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背景神经胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,其发病率和致死率均较高,目前常用的治疗方式包括手术切除及放化疗。然而由于手术切除受限、药物治疗的局限性及残余瘤细胞的潜在复发性,其中位生存率低、复发率高。另外,由于胶质瘤其生长部位独特的生理屏障作用,以及传统的抗癌药物分子不能辨别病变细胞与正常细胞,实际到达肿瘤区域的治疗药量非常有限,同时还造成了正常组织不可避免的损伤。已有研究表明,纳米药物输送系统（Nanostructured delivery systems,NDS）因其具有克服非特异性吞噬、在肿瘤部位聚集与肿瘤细胞结合并进入细胞以及药物控释的功能,被视为理想的药物载体。但是由于颅内生理屏障的作用,神经胶质瘤中有关NDS的报道较少,其对神经胶质瘤的治疗效应有待进一步研究。目前,化疗联合免疫治疗在多种肿瘤中达到了良好的治疗效果,免疫检查点抑制剂是免疫治疗中最有效的方式之一,但是在胶质瘤中联合治疗效应则有待进一步研究。并且由NDS介导的针对胶质瘤的化疗联合免疫治疗则暂未见报道。为了提高胶质瘤治疗中药物的有效利用率及化疗联合免疫治疗效应,我们研究出具备以下性质的NDS:可穿过颅内屏障,靶向肿瘤细胞增加胶质瘤区药物浓度,实现肿瘤细胞内药物控释;并且可同时携带化疗药物及免疫抑制剂,对胶质瘤进行联合治疗,最终达到抗胶质瘤治疗效应。目的本研究设计合成一种新型纳米载药传输系统,这种纳米系统具有靶向肿瘤细胞及双重载药控释功能,可以同时携带抗癌药物阿霉素（Doxorubicin,DOX）和免疫检查点抑制剂1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophan,1MT）靶向到达颅内胶质瘤区域,在杀伤肿瘤细胞的同时激活抗肿瘤免疫反应,增加原位胶质瘤模型小鼠的抗肿瘤效应。方法（1）化学合成法制备1MT,参照标准的“Fmoc化学”方法,合成多肽序列AD-PEG8-KDEVD-1MT以及AD-PEG8-G-iRGD。使用制备的介孔硅纳米颗粒（Mesoporous silica nanoparticles,MSN）合成炔基修饰的双硫功能化介孔硅纳米颗粒,合成及连接叠氮-β-CD,制备环糊精封堵的介孔硅药物控释系统（DOX@MSN-SS-CD）、多肽序列功能化的介孔硅药物控释系统（DOX@MSN-SS-iRGD）及双重载药的介孔硅药物控释系统（DOX@MSN-SS-iRGD&1MT）。使用核磁共振氢谱及傅里叶红外光谱检测合成多肽表征。透射电子显微镜以及扫描电子显微镜检测MSN及DOX@MSN-SS-iRGD&1MT表征。荧光分光光度计及高性能液相色谱仪检测体外DOX@MSN-SS-iRGD&1MT药物释放。MTT实验检测体外DOX@MSN-SS-iRGD&1MT对神经胶质瘤细胞杀伤效应。（2）构建稳定表达荧光素酶的神经胶质瘤GL261细胞（GL261-luc）,并使用GL261-luc细胞构建C57/BL6小鼠原位胶质瘤模型。小动物活体成像技术检测小鼠颅内肿瘤大小,筛选出相似荧光强度原位胶质瘤模型小鼠,并将其随机分为四组,分别腹腔注射DOX+1MT、DOX@MSN-SS-CD、DOX@MSN-SS-iRGD及DOX@MSN-SS-iRGD&1MT。注射后12h、24h、36h、48h,对各小鼠进行采血并完整解剖取出小鼠主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）。小鼠血液进行血常规及血生化分析,小鼠脏器通过IVIS系统进行成像分析。同时使用ICP-MS实验检测注射DOX@MSN-SS-CD、DOX@MSN-SS-iRGD及DOX@MSN-SS-iRGD&1MT 48h后,小鼠颅内胶质瘤组织中硅含量。表面活性剂辅助组织清除技术及三维荧光成像技术检测腹腔注射DOX@MSN-SS-iRGD&1MT 36小时后,小鼠颅内DOX聚集情况。（3）提取C57/BL6小鼠脾淋巴细胞与GL261细胞共培养,给予PBS、DOX+1MT、DOX@MSN-SS-CD、DOX@MSN-SS-iRGD以及DOX@MSN-SSiRGD&1MT处理48h后,流式细胞术检测共培养细胞中CD3+T细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞比例。（4）构建C57/BL6小鼠原位胶质瘤模型,随机分为5组,术后第五天开始分别给予腹腔注射PBS、DOX+1MT、DOX@MSN-SS-CD、DOX@MSN-SS-iRGD以及DOX@MSN-SS-iRGD&1MT,每隔两天注射一次,共注射5次。观察并记录小鼠体重变化及生存时间,并绘制体重曲线及生存曲线。同时在术后第五天开始进行小动物活体成像检测观察肿瘤大小,后期每隔4天进行一次小动物活体成像检测,共检测4次。成瘤术后第20天对各组小鼠进行MRI检查及脑组织切片HE染色观察肿瘤大小。（5）免疫组化染色检测颅内肿瘤组织中CD34及Ki-67表达,免疫荧光共聚焦实验检测肿瘤组织中CD8+T细胞、CD86+DCs及Grz B的表达,表面活性剂辅助组织清除技术及三维荧光成像技术检测DOX@MSN-SS-iRGD&1MT处理组小鼠肿瘤区CD8+T细胞表达。流式细胞术检测小鼠血液中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞比例及CD8+T细胞GrzB的表达。ELISA检测小鼠胶质瘤区域炎症因子TNF、IFNγ、IL-10及IL-17的分泌情况。Western Blot检测小鼠胶质瘤区域相关蛋白STING、IFNα/β、p-STAT3的表达水平。结果（1）核磁氢谱结果证明1MT结构的准确性,质谱分析结果证明多肽序列AD-PEG8-KDEVD-1MT及AD-PEG8-G-iRGD的化学结构正确。扫描电镜及透射电镜证实MSN的有序多孔结构以及DOX@MSN-SS-iRGD&1MT表面覆盖连接层。傅里叶红外光谱检测各合成材料表面电势,证明各合成步骤修饰材料的准确性。荧光分光光度计及高性能液相色谱仪结果显示:GSH存在的条件下,DOX@MSN-SS-iRGD&1MT内部包裹的药物分子DOX被迅速地释放出来,1MT在caspase3存在时其连接的肽链可断裂将其释放。MTT结果显示:DOX@MSN-SS-iRGD&1MT对胶质瘤GL261细胞杀伤效应显著。以上结果表明,我们成功合成了双重载药控释功能的联合载药纳米系统,DOX@MSN-SS-iRGD&1MT,其在体外对胶质瘤GL261细胞有显著杀伤作用。（2）D-luciferin检测结果显示:lucifearas慢病毒转染GL261细胞的效率大于90%。小动物活体成像联合CT扫描三维重建结果显示:C57/BL6小鼠原位胶质瘤模型成功构建。小动物活体成像结果显示:腹腔注射后12h,iRGD修饰纳米材料处理组小鼠颅内可见DOX荧光聚集,其余器官聚集浓度低,在无iRGD修饰组肝脏显示较强的DOX荧光聚集;腹腔注射后36h内,iRGD修饰纳米材料处理组小鼠颅内DOX荧光强度不断增加,而对照组则显示在肝脏中的强显影;当腹腔注射后48h时,与无iRGD修饰组相比,iRGD修饰组小鼠颅内仍可见少许DOX荧光聚集,而无iRGD修饰组体内已无DOX荧光成像。ICP-MS实验结果显示:iRGD修饰纳米材料在肿瘤区域硅元素聚集浓度显著增高。以上结果表明,iRGD修饰纳米材料可将其载药携带至颅内胶质瘤区域,增加药物在胶质瘤的浓度以及减缓其在颅内胶质瘤中的代谢速率。（3）在GL261细胞与C57/BL6小鼠共培养时,DOX@MSN-SS-iRGD&1MT与传统联合给药组均可显著增加CD3+CD8+T淋巴细胞比例,降低CD3+CD4+T淋巴细胞比例,CD3+CD4+T淋巴细胞:CD3+CD8+T淋巴细胞比率亦显著降低。以上结果表明,合成材料DOX@MSN-SS-iRGD&1MT在离体共培养细胞体系中可显著影响淋巴细胞比例,增加具有细胞杀伤功能的CD3+CD8+T淋巴细胞。（4）生存率分析结果显示:DOX@MSN-SS-iRGD&1MT可显著延长原位胶质瘤C57/BL6小鼠生存时间。小动物活体成像结果显示:DOX@MSN-SS-iRGD&1MT处理组小鼠颅内荧光强度未见显著增强。MRI及HE染色结果显示:DOX@MSN-SS-iRGD&1MT处理组小鼠颅内肿瘤较其它四组显著减小。以上结果表明,DOX@MSN-SS-iRGD&1MT在C57/BL6小鼠原位胶质瘤模型中可显著抑制肿瘤细胞增殖,增强抗胶质瘤效应。（5）免疫组化结果显示:DOX@MSN-SS-iRGD&1MT处理组小鼠胶质瘤区域肿瘤血管形成及细胞增殖率显著降低。免疫荧光及表面活性剂辅助组织清除技术及三维荧光成像技术结果显示:DOX@MSN-SS-iRGD&1MT处理组小鼠胶质瘤区域可见显著CD8+T淋巴细胞及CD86+DCs浸润,细胞毒性因子GrzB表达显著增加。流式细胞术结果显示:DOX@MSN-SS-iRGD&1MT处理组小鼠血液及脾脏CD3+CD8+T淋巴细胞比例显著增加,CD3+CD4+T细胞:CD3+CD8+T细胞比率显著降低。并且DOX@MSN-SS-iRGD&1MT处理组小鼠血液中CD8+T细胞GrzB的表达显著增加。ELISA结果显示:DOX@MSN-SS-iRGD&1MT可促进小鼠胶质瘤区域TNF、IFNγ及IL-17的表达,抑制IL-10的表达。WB结果显示:DOX@MSN-SS-iRGD&1MT可增加胶质瘤组织中STING、IFNα/β蛋白表达,降低p-STAT3蛋白表达。以上结果表明,DOX@MSN-SS-iRGD&1MT在杀伤小鼠胶质瘤细胞的同时可以活化DCs,激活并促进CD8+T细胞增殖,从而增加抗肿瘤生长因STING、IFNα/β、TNF、IFNγ及IL-17的表达,降低炎症抑制因子IL-10及p-STAT3蛋白表达。结论（1）新型双重载药纳米系统,DOX@MSN-SS-iRGD&1MT,可同时将DOX及1MT携带至颅内胶质瘤区域,增加肿瘤区药物浓度并且减缓其代谢速率。（2）DOX@MSN-SS-iRGD&1MT可显著提高DOX与1MT联合治疗的有效性,抑制胶质瘤的生长。在杀伤小鼠胶质瘤细胞的同时活化DCs,激活并促进CD8+T细胞增殖,增加细胞毒性因子GrzB的表达,从而促进抗肿瘤生长因STING、IFNα/β、TNF、IFNγ及IL-17的表达,抑制IL-10及p-STAT3蛋白表达。