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目的:探讨miR-23a-3p对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）成骨分化的影响,以及在此过程中miR-23a-3p与Wnt/β-catenin通路的相互作用,为hPDLSCs成骨分化、正畸牙周组织改建和骨再生的研究提供分子生物学理论依据。方法:1.收集因正畸需求拔除的健康前磨牙,运用组织块培养法行体外培养原代hPDLSCs,有限稀释法纯化分离培养细胞。传代后取第三代hPDLSCs通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测其增殖能力并绘制生长曲线,用流式细胞术、免疫组织化学染色、集落形成试验、骨向/脂向诱导实验进行细胞鉴定。2.构建沉默miR-23a-3p的慢病毒载体,摸索最适感染复数（Multiplicity of Infection,MOI）值后,经q RT-PCR实验检测miR-23a-3p沉默的效果并采取CCK-8法检测慢病毒转染对hPDLSCs增殖能力的影响。3.设置分组:Blank组、miR-23a-3p inhibitor组、inhibitor NC（inhibitor negative control）组。对各组hPDLSCs进行7天成骨诱导,通过q RT-PCR和Western Blot实验测定成骨相关因子ALP、RUNX2的m RNA和蛋白表达变化,评估成骨分化情况。4.hPDLSCs转染miR-23a-3p inhibitor慢病毒72h后,检测Wnt/β-catenin通路关键分子β-catenin的m RNA和蛋白表达情况。5.采用CCK-8检测浓度为100ng/m L的Wnt/β-catenin通路阻断剂DKK1对hPDLSCs增殖活性的影响。在培养基加入DKK1作用72h后,对Wnt/β-catenin通路关键分子β-catenin的m RNA和蛋白表达情况进行检测。6.设置分组:Blank组、miR-23a-3p inhibitor组、inhibitor NC组、DKK1、miR-23a-3p inhibitor+DKK1组、inhibitor NC+DKK1组,共6组。DKK1的干预为在成骨诱导液中加入DKK1,各组hPDLSCs成骨诱导7天后提取RNA和蛋白,经q RT-PCR和Western Blot测定成骨相关因子ALP、RUNX2及Wnt/β-catenin通路相关因子β-catenin、p-GSK-3β及Cyclin D-1的表达变化。结果:1.本实验成功培养了原代hPDLSCs,经传代分离培养后第3-5代hPDLSCs形态稳定、生长情况良好,故选择其作为研究对象。所获得的hPDLSCs镜下呈现放射状生长,长梭形;细胞增殖曲线呈“S”型趋势;流式细胞仪检测的细胞表面分子标志物及细胞周期符合干细胞特性;免疫荧光染色显示波形蛋白为阳性表达,角蛋白为阴性表达,表明细胞为间充质来源;此外,培养的细胞具有良好的克隆、成骨和成脂分化能力。2.慢病毒转染的最适MOI为20,其对hPDLSCs的增殖能力无影响（P＞0.05）。miR-23a-3p inhibitor组的miR-23a-3p表达水平明显低于inhibitor NC组（P＜0.05）。3.成骨诱导7天后,与inhibitor NC组相比,miR-23a-3p inhibitor组ALP、RUNX2的m RNA和蛋白表达量均显著升高（P＜0.05）。4.hPDLSCs转染慢病毒72h后,miR-23a-3p inhibitor组β-catenin的m RNA和蛋白水平较inhibitor NC组明显上调（P＜0.05）。5.DKK1可显著降低β-catenin的m RNA和蛋白水平（P＜0.05）,且其对hPDLSCs的增殖能力无影响（P＞0.05）。6.成骨诱导7天后,与inhibitor NC组相比,miR-23a-3p inhibitor组β-catenin、Cyclin D-1的m RNA表达量及β-catenin、p-GSK-3β及Cyclin D-1的蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,表明沉默miR-23a-3p可使hPDLSCs成骨分化过程中Wnt/β-catenin通路活性上调;DKK1可下调各组的成骨因子及Wnt/β-catenin通路相关因子表达（P＜0.05）;尽管DKK1抑制了miR-23a-3p inhibitor组成骨分化和Wnt/β-catenin通路活性,但其成骨相关因子及Wnt/β-catenin通路相关因子表达水平仍高于inhibitor NC+DKK1组（P＜0.05）。结论:1.本研究采用组织块培养法和有限稀释法成功培养了hPDLSCs。2.沉默miR-23a-3p促进hPDLSCs的成骨分化,并激活了Wnt/β-catenin通路。3.DKK1阻断Wnt/β-catenin通路后,可显著下调沉默miR-23a-3p对hPDLSCs的促成骨分化能力。沉默miR-23a-3p通过激活Wnt/β-catenin通路促进hPDLSCs体外成骨分化。