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恶性肿瘤的形成病因复杂，诱因繁多，细胞内信号通路繁冗交叉，且同时存在多种基因的突变，涉及范围及因素极为庞杂，其药物治疗一直是极大的难题。近年来，随着单克隆抗体的发现与发展，肿瘤的治疗取得了较大的进展。单克隆抗体靶标明确，疗效显著。且临床应用不良反应少，安全性好，已作为一线药物大量应用于多种恶性肿瘤的临床治疗中。然而，单一靶点的抗体适用性窄，仅针对一部分肿瘤细胞有疗效，且极易产生耐药性。另一方面，全长抗体能同时结合到两个相邻的抗原表位或分子，从而增强了亲和功能，且能够延长存留时间。然而因其分子量高达150kDa，全长抗体无法快速传统组织，难以在病灶部位浓集，无法达到有效治疗浓度。因此，研制小分子量、多靶点的类抗体蛋白药物已成为肿瘤的抗体领域的重要发展方向。肿瘤的发生发展过程中会大量分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor, VEGF）,在肿瘤组织内大量诱导生成新生血管，为瘤体的扩张提供必需的养料。同时，肿瘤的增殖转移与表皮因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）家族的过量表达密切相关，故表皮生长因子受体家族与血管内皮生长因子是肿瘤治疗的重要靶标[1]。本课题主要组成如下：（1）通过Linker将KDR-D3与Herstatin的C末端的79个氨基酸（HERIN）融合，构建EGFR-VEGF多靶向融合蛋白。并将其与突变改造后的人抗体IgG1Fc段融合，引入抗体的ADCC （antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity）效应，同时还可增强融合蛋白的稳定性，提高蛋白在体内的半衰期。（2）在此基础上，利用纤毛嵌合型腺病毒（Ad5/35）携带HERIN-KDR-D3-FC （EVP3）表达框，构建重组腺病毒Ad5/35-EVP3，将该病毒对293细胞进行体外感染可获得融合蛋白EVP3。（3）将获得的融合蛋白EVP3经亲和层析方法纯化后，通过ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）和Western blotting方法对其进行定性及定量研究。利用间接免疫荧光实验（IFA）和ForteBio Octet Red96生物分子相互作用分析系统对融合蛋白EVP3与各靶标间的亲和力进行定性研究与定量测量。结果表明，融合蛋白EVP3在腺病毒Ad5/35-293细胞系统能够得以有效表达，且纯化后的蛋白EVP3与VEGFR、EGFR、HER2均具有良好的结合能力，与抗原HER2、EGFR、VEGFR的亲和力常数KD分别为1.95×10-8mol/L，8.47×10-9mol/L，5.75×10-9mol/L，为后续的体内外抗肿瘤作用的进一步研究奠定了基础。