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目的:当体温调定点升高超过人体正常体温0.5-1.3℃时,就会发热。发热是人和许多动物的共同疾病特征,并且在人体抵抗疾病的进展过程中起着关键作用。除此之外,在卒中、创伤性脑损伤、颅内出血等许多临床疾病的恢复过程中常伴随发热症状,此时的发热会给大脑带来二次损伤。因此探索发热对大脑的影响有非常重要的临床意义。42℃或一般的严重高热已被证明会不可逆转地损害脑细胞的结构,相比之下,人们对轻度发热(38-39℃)时大脑发生的变化知之甚少。本研究旨在探索轻度发热对海马神经元突触结构可塑性的影响。方法:1.准备两个二氧化碳细胞培养箱,一个温度设置为37℃,另一个温度设置为39℃,为神经元提供不同的温度环境。2.采用台盼蓝染色法对不同温度处理后的神经元染色,观察轻度发热对海马神经元存活率的影响。3.采用免疫荧光实验(Immunofluorescent staining)的方法,结合共聚焦显微镜,观察轻度发热对突触前膜结构蛋白Bassoon(BSN)、位于兴奋性囊泡表面的谷氨酸转运蛋白v Glut1以及位于突触后膜的谷氨酸受体AMPARs的含量以及位置的影响。4.采用Syn-PER试剂盒提取神经元中的突触蛋白。5.采用Western blot的方法,观察轻度发热后皮层神经元突触蛋白中BSN以及vGlut1含量的变化。6.采用TMT蛋白定量的方法,检测差异蛋白,并进行GO富集分析与KEGG富集分析,寻找相关信号通路。结果:1.轻度发热对海马神经元存活率的影响:将海马神经元置于39℃培养箱过夜处理,之后进行台盼蓝染色,每组统计一百个神经元计算其存活率,其中37℃对照组海马神经元存活率为93%,39℃实验组海马神经元存活率为91%,即轻度发热不影响海马神经元存活率。2.轻度发热2 h对海马神经元突触中兴奋性囊泡含量的影响:海马神经元在39℃环境中处理2 h后,与37℃对照组相比v Glut1含量显著降低(P<0.01),这表明轻度发热2 h后,突触中负载神经递质的囊泡含量显著降低。3.轻度发热2 h对海马神经元突触前膜囊泡释放位点功能的影响:海马神经元在39℃环境中处理2 h后,与37℃对照组相比BSN含量无显著改变(P>0.05),这表明轻度发热2 h后,突触前膜的囊泡释功能放并不受到影响,即发热不影响突触前膜释放神经递质的功能。4.轻度发热2 h对海马神经元突触前膜可以释放的兴奋性突触囊泡的影响:海马神经元在39℃环境中处理2 h后,与37℃对照组相比Active Zone(AZ)区域的兴奋性突触囊泡含量显著降低(P<0.05),这提示我们轻度发热会影响兴奋性突触囊泡在突触前膜的位置,减少处于释放状态的兴奋性囊泡数量。5.轻度发热过夜后对海马神经元突触中兴奋性囊泡含量的影响:海马神经元在39℃环境中过夜后,与37℃对照组相比v Glut1含量有降低趋势,其降低趋势没有2h的处理显著。6.轻度发热过夜后对海马神经元突触前膜囊泡释放位点的影响:海马神经元在39℃环境中过夜后,与37℃对照组相比BSN含量无显著改变(P>0.05),这表明随着发热时间的延长,突触前膜的囊泡释功能放并不受到影响,即发热并不影响突触前膜释放神经递质的功能。7.轻度发热过夜后对海马神经元突触前膜可以释放的兴奋性突出囊泡的影响:海马神经元在39℃环境中过夜后,与37℃对照组相比AZ区域的兴奋性突触囊泡含量显著降低(P<0.01),其降低程度比2 h的情况下(P<0.05)要高,这表明,随着轻度发热时间的延长,兴奋性突触囊泡在突触前膜的位置发生了改变,兴奋性突触囊泡远离突触前膜的囊泡释放位点,即轻度发热重塑了海马神经元突触前膜的结构。8.轻度发热过夜后对海马神经元突触后膜谷氨酸受体AMPARs的影响:海马神经元在39℃环境中过夜后,与37℃对照组相比突触后膜兴奋性谷氨酸受体AMPARs含量无显著变化(P>0.05),这表明轻度发热并不影响突触后膜的功能。9.轻度发热对皮层神经元突触的影响:皮层神经元在39℃环境中过夜后,与37℃对照组相比,其BSN以及v Glut1含量均无明显变化(P>0.05),这表明,轻度发热对海马神经元突触与皮层神经元的突触的影响不同。10.蛋白定量分析表明,胰岛素信号通路可能参与轻度发热引起的突触前膜结构的重塑过程。结论:1.轻度发热通过重塑海马神经元突触前膜的结构使其突触前膜处于抑制状态,轻度发热2h后突触前膜负载兴奋性神经递质谷氨酸的突触囊泡含量减少,并且位于突触前膜神经递质释放区域的突触囊泡含量也显著降低,这些都说明轻度发热会抑制突触前膜的活动。2.海马神经元在39℃的环境中过夜处理后,其突触前膜神经递质释放区域中突触囊泡的含量降低程度比39℃处理2h的情况更显著。这表明轻度发热对突触前膜的抑制作用随着时间的增加而增强。3.海马神经元在39℃的环境中过夜处理后,突触后膜AMPARs的含量没有变化,这提示轻度发热对海马神经元突触后膜可能无影响。4.轻度发热时在海马神经元突触中显著降低的突触蛋白在皮层神经元中并无显著变化,这说明轻度发热对海马神经元的突触与皮层神经元的突触有不同的调节作用。