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目的:目前ROS在干细胞生物学中的作用还没有得到充分说明和了解。在过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激条件下,我们比较小鼠角膜上皮祖细胞(TKE2)[1]和成熟的小鼠角膜上皮细胞(MCE)的不同反应,重点研究是角膜干细胞的抗氧化细胞特性及相关机制。 方法:以小鼠角膜上皮祖细胞(TKE2)和成熟的小鼠角膜上皮细胞(MCE)为细胞模型,通过CCK8细胞活性实验检测不同浓度H2O2对小鼠角膜上皮的祖细胞(TKE2)和成熟的小鼠角膜上皮细胞(MCE)的影响。利用H2O2处理细胞24小时后,通过流式细胞术检测细胞内ROS的水平,利用免疫荧光染色检测细胞内氧化应激标志物3-硝基酪氨酸(3-NT)表达情况,通过实时定量PCR(qRT-PCR)、免疫荧光染色、免疫印迹等方法检测细胞主要Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信号通路及细胞自噬水平的激活情况。往培养基中加入5%胎牛血清,得到分化的TKE2细胞。在H2O2处理24小时后,通过检测分化的TKE2细胞内ROS产生关键酶-NOX4及细胞主要Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信号通路的激活情况,进一步论证TKE2具有一定的抗氧化性质。 结果:细胞活性实验结果显示,在相同应激条件下,TKE2细胞则表现出较强的拮抗作用,而MCE细胞存活受到抑制,且呈浓度依赖关系。活性氧(ROS)实验测定与ROS标记物3-NT结果显示,在相同应激条件下,TKE2细胞内ROS/3-NT表达降低,而MCE细胞内ROS/3-NT表达升高;相关抗氧化性机制研究表明(相同应激条件),TKE2细胞内重要抗氧化应激信号通路的Keap1-Nrf2-ARE被激活,而MCE细胞内应答较低。另一方面,H2O2诱导4小时后,TKE2细胞中相关自噬标志物:Beclin1,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均上调,而P62蛋白表达下调;MCE细胞中Beclin1,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均下调,而P62蛋白表达上调。结果提示在氧化应激的早期阶段,TKE2细胞中自噬被激活,而MCE细胞的自噬未被激活或被抑制。而在H2O2诱导24小时后,未观察到TKE2和MCE细胞中自噬的明显改变。TKE2细胞与分化后的TKE2细胞比较结果证实:H2O2处理分化的TKE2细胞24小时后,测定细胞内ROS产生关键酶-NOX4表达升高,且重要抗氧化应激信号通路Keap1-Nrf2-ARE未被激活,提示TKE2干细胞具备一定的抗氧化性质。 结论:在H2O2诱导的氧化应激条件下,小鼠角膜上皮祖细胞TKE2较成熟小鼠角膜上皮MCE细胞具有显著的抗氧化应激细胞特性,其机制是较强地激活抗氧化应激信号通路Keap1-Nrf2-ARE及早期自噬而实现的。结果首次提示角膜干细胞具有较强的抗氧化能力,对角膜干细胞以及其他干细胞的治疗及其他应用具有潜在的意义。