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菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一,用途和栽培地域极广,观赏和经济价值很高,在花卉生产中占有十分重要的地位。盐胁迫严重影响植物的生长和发育,在切花菊设施栽培中土壤次生盐渍化及我国大面积盐渍土是制约菊花生产与园林应用的主要因子;菊花及其近缘种属植物资源丰富,耐盐性差异很大。对耐盐性差异的菊花及其近缘种属植物耐盐机理研究及耐盐优异基因挖掘是加快培育耐盐菊花新品种的基础。此外,菊花是浅根观赏花卉,忌水湿,夏季田间积涝会导致其大面积死亡;涝与盐协同胁迫对菊花生长产生的伤害更大,因此有必要对两者协同胁迫的机制进行研究。本文研究的主要内容与结论如下:1.对菊花’神马,及其3种近缘种属植物(牡蒿、芙蓉菊和大岛野路菊)苗期进行200 mM NaCl处理,分别从形态和根、茎、叶各部位Na+含量两个方面评价4种植物的耐盐性。结果表明,NaCl处理第7 d时,’神马’叶片首先表现萎蔫和黄化,大岛野路菊叶片在NaCl处理第10 d时表现出相似的症状,而芙蓉菊和牡蒿叶片在第14 d时依旧没有明显伤害;且经NaCl胁迫后,4种植物各部位Na+含量均显著增加,芙蓉菊和牡蒿增加量最少,大岛野路菊次之,’神马’增加量最多。以上结果表明,芙蓉菊和牡蒿耐盐性极强,大岛野路菊耐盐性强,’神马’为盐敏感植物;且NaCl胁迫后,盐敏感材料中Na+增加量多于耐盐材料。2.质膜型Na+/H+逆向转运蛋白SOS1是植物受到高盐胁迫的第一道屏障,也是植物长期耐盐胁迫的有效机制。为了明确菊花及其3种近缘种属植物离子稳态及耐盐性差异的分子机制,分别克隆其质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1s基因,各自命名为AjSOS1、CrcSOS1、CcSOS1 和 CmSOS1。序列分析发现,AjSOS1 和 CrcSOS1 均编码1147个氨基酸,CcSOS1和CmSOS1均编码1145个氨基酸。二级结构预测表明4个SOS1s蛋白N端具有12个跨膜结构域,C端具有约700个氨基酸残基的亲水胞质长尾。氨基酸序列比对发现4个SOS1s蛋白与已知植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白同源性很高,达90.32%-94.68%。系统进化分析表明,4个SOS1s和菊芋HtSOS1及番茄S1SOS1亲缘关系最近。时空表达模式分析发现,盐处理均诱导4个SOS1s基因表达上调,AjSOS1和CrcSOS1转录水平较高。3.将4个SOS1s基因导入质膜Na+泵ATPase ENA1-4和质膜Na+/H+逆向转运体NHA1均缺失的酵母突变体ANT3。结果表明:4个SOS1s均能回补ANT3突变体对Na+的转运功能;在含70 mM NaCl的AP培养基上,酵母细胞表达AjSOS1长势最好,CrcSOS1 次之,CcSOS1 长势弱于 CrcSOS1,强于 CmSOS1,而 CmSOS1 长势最差。为了进一步明确4个SOS1s基因回补能力差异的原因,在比较AjSOS1和CmSOS1氨基酸序列差异基础上,采用定点突变技术产生一系列AjSOS1muts。通过其对酵母突变体ANT3的回补实验,发现一些可能影响AjSOS1活性的重要关键氨基酸位点,例如:位于N端跨膜区的G13E、T26S、F143I和V238L及位于C端胞质尾区的Y463H、Y549H、S639L、A919T、YG927HS、G982V、A1027V、N1109K 和 G1127A 等。4.构建4个SOS1s基因植物遗传转化表达载体pMDC32-SOS1s,分别采用农杆菌介导的叶盘法和拟南芥花粉管侵染法将4种载体转入盐敏感材料’神马’、拟南芥野生型gl1和突变体sos1-1,获得超表达株系。盐处理转基因菊花株系发现,超表达SOS1s基因能减少植株体内Na+含量积累和增加K+含量,提高K+/Na+,增强植株的耐盐性。此外,在含盐培养基上转基因拟南芥种子萌发率和植株根长、鲜重均高于对应的拟南芥对照。总之,通过对超表达转基因株系盐处理发现,来自耐盐植物中的SOS1s比从盐敏感植物中分离的SOS1s有较强的耐盐性。5.构建 pBIG-CmSOS1-overexpress、antisense 和 amiRNAi 表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法进行同源遗传转化’神马’。盐和淹水协同胁迫14 d后,转基因株系中正义株系的存活率(49%-51%)显著高于转空载株系(31%),而反义和人工干扰株系的存活率显著低于转空载株系,仅为20%-22%,表明超表达CmSOS1提高了转基因株系的耐盐和耐涝性;反义和干扰CmSOS1均降低了转基因株系的耐盐和耐涝性。此外,胁迫条件下,正义株系叶片中相对电导率、MDA及H2O2和O2-含量均低于转空载株系,而可溶性蛋白含量及SOD和CAT等抗氧化酶活性都高于转空载株系;上述指标在反义和干扰株系中与正义株系相反,表明CmSOS1基因通过维持植物体内细胞膜的完整性及增强抗氧化酶活性清除过多的活性氧从而介导菊花耐盐和耐涝性。