大菱鲆(Scophthalmus maximus)属于鲽形目、鲆科、菱鲆属,二十世纪九十年―跨洋引种‖引入我国,大菱鲆对夏季高温耐受能力较差。因受水温条件限制,我国北方主要采用―养殖大棚+深井海水‖模式进行养殖,但近年来,随着地下海水的匮乏、南北接力养殖模式的出现,养殖生产中对大菱鲆耐高温新品种的需求日益增加。另外,随着分子技术的发展,应用分子生物学手段,加快开展大菱鲆耐热性状的分子机制研究,对于培育耐高温的养殖品种具有较大的研究意义。本研究论文通过高通量测序手段,建立了大菱鲆热应激条件下肾脏转录组数据库,其中泛素蛋白酶体系相关的差异基因被显著富集,对关键基因开展分子克隆及功能验证,对于热应激分子机制研究提供数据参考及理论支持;同时在本实验室获得的耐高温QTL基础上,开展共享QTL标记挖掘,为分子标记育种研究提供可靠的标记基础。具体研究结果如下:1.为探索大菱鲆耐高温的分子机制,筛选耐高温相关基因,采用高通量测序平台(IlluminaHiSeq-2500)分别对5个不同高温处理组的大菱鲆肾脏进行转录组测序,进行生物信息学分析,包括GO(基因功能注释)、SSR(简单重复序列)分析等。获得的主要结果如下:通过组装得到Unigenes总数目为68525,长度范围为201-23456bp,平均长度1124bp,N50长度2316bp。将Unigenes分别在Nr、Swissprot、KEGG、KOG、GO数据库进行序列比对及功能注释,共注释25498条,其中Nr数据库注释到的Unigenes最多;按GO功能分类,共分为细胞组分、分子功能以及生物学过程3类,包括56个功能组,其中大量Unigenes与细胞进程、代谢过程、催化活性,生物调节,应激反应相关。进一步将Unigenes进行pathway注释,归属于218条代谢通路,分类为5类KEGG途径:代谢途径、遗传信息处理、细胞过程、环境信息和生物系统。进行转录因子分析,共检测到65类转录因子,其中C2H2锌指蛋白家族的基因数目最多。通过对不同温度胁迫下基因表达谱结果进行分析,不同温度组之间存在着较为显著的差异,在不同温度胁迫组中20℃组与28℃组存在差异最大,差异基因达到4734个,其中上调基因3386个,下调基因1348个。本研究建立了大菱鲆热应激肾脏转录组数据库,为大菱鲆高温胁迫分子机理研究提供了丰富的数据参考。2.近年来研究表明发现生物在逆境胁迫条件下产生异常或受损蛋白质,并在机体内加速积累,影响细胞的新陈代谢,最终破坏细胞结构和功能的完整性,随着异常代表的积累增加,蛋白降解在维持细胞稳态过程中起着至关重要的作用;其中泛素蛋白酶体系统在应激的感知、信号的转导、应激反映通路的激活中均发挥积极作用。本研究在前章利用高通量测序平台获得5个不同温度处理的大菱鲆肾脏转录组测序数据,通过生物信息学分析,获得大量表达显著差异基因(DGEs),挑选显著富集KEGG通路——泛素蛋白酶体系统中关键基因(泛素结合酶E2 H,泛素连接酶E3-CBL)开展全长克隆及表达分析等相关研究。克隆获得大菱鲆UBE2H基因cDNA序列全长为745bp。该基因ORF可编码一个由183个氨基酸残基组成的蛋白质,相对分子质量为23.95kDa,理论等电点为4.87。大菱鲆CBL基因cDNA序列全长为2263bp。该基因ORF可编码一个由528个氨基酸残基组成的蛋白质,相对分子质量为72.19kDa,理论等电点为7.89。3.本研究在前期构建的大菱鲆高密度遗传连锁图谱和耐高温QTL分析的基础上,筛出15个与耐高温相关的SNP位点,设计出可用于HRM检测的SNP扩增引物15对。在四个家系中利用HRM小片段法对这15个耐高温相关的SNP位点进行分型并结合之前构图家系相关性状数据进行QTL位点验证。QTL验证结果表明M19194中的CC基因型,M33439中的CC基因型,以及M12898中的TT和AT基因型与耐高温性状相关性显著。品种间共享QTL的发掘能够扩展QTL标记的使用空间,减少新品种重新构建图谱进行QTL标记定位的工作量和成本。为分子辅助育种生产提供数据帮助。