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第一部分温阳泄浊通络方治疗早中期慢性肾衰竭患者的临床研究目的:综合评价温阳泄浊通络方治疗早中期慢性肾衰竭(CRF)患者的临床疗效。方法:按照纳入排除标准选取早中期CRF患者80例,随机分为对照组和试验组,在一般治疗的基础上分别予以尿毒清颗粒和温阳泄浊通络方加减治疗12周,检测记录两组治疗前后临床症状积分、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、肾小球滤过率(GFR)、24h尿总蛋白(24h UTP),同时观测安全性指标。结果:1病例基线情况两组患者性别、年龄、病程分布无统计学差异(P>0.05),治疗前临床症状积分、Scr、BUN、GFR、24h UTP均无明显差异(P>0.05),具有可比性。2两组治疗后疾病疗效比较对照组显效10例,有效14例,稳定7例,无效6例,总有效率约为83.78%;试验组显效19例,有效12例,稳定4例,无效3例,总有效率约为92.11%。两组比较,试验组疾病有效率显著高于对照组(P<0.05)。3两组治疗前后临床症状积分比较与本组治疗前比较,两组治疗后临床症状积分均明显下降(P<0.05);两组治疗后比较,试验组临床症状积分明显低于对照组(P<0.05)。4两组治疗前后Scr、BUN、GFR的比较与本组治疗前比较,治疗后两组Scr、BUN均明显下降(P<0.05),GFR明显升高(P<0.05);两组治疗后比较,试验组Scr、BUN明显低于对照组(P<0.05),GFR明显高于对照组(P<0.05)。5治疗前后24h UTP的比较与本组治疗前比较,试验组治疗后24h UTP明显下降(P<0.05),对照组无明显变化(P>0.05);两组治疗后比较,试验组24h UTP明显低于对照组(P<0.05)。6安全性指标观察治疗前后两组患者体温、脉搏、呼吸、血压、血常规、便常规、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、电解质、心电图均无明显变化,治疗期间无不良反应事件发生。第二部分温阳泄浊通络方对慢性肾衰竭大鼠生化指标及肾脏病理改变的干预作用目的:观察温阳泄浊通络方对CRF大鼠血清生化指标及肾脏病理改变的影响,验证温阳泄浊通络方的肾脏保护作用。方法:健康雄性SD大鼠40只,随机选取8只为假手术组(Sham),仅行开腹手术,无肾实质损伤;其余32只行5/6肾切除术建立慢性肾衰竭模型。造模完成后随机分为模型组(5/6NX)、温阳泄浊通络方组(WXT)、氯沙坦组(LST),并分别予以相应药物灌胃。干预12周后,留尿检测24h UTP,取血检测各组大鼠Scr、BUN、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血脂、电解质等指标,并取肾组织进行HE、Masson染色观察其病理改变,分析其纤维化程度。结果:1大鼠一般状况实验期间,5/6NX组大鼠死亡2只,LST组死亡2只,WXT组及Sham组无大鼠死亡。Sham组大鼠精神状况良好,日常饮食、饮水正常,反应敏捷,体毛柔顺且色泽明亮。与Sham组大鼠相比,5/6NX组大鼠精神欠佳,活动量、摄食量减少,体毛粗糙而无光泽。与5/6NX组相比,WXT组大鼠精神逐渐改善,活动量、摄食量增加,体毛较有光泽;LST组改善不明显。与Sham组相比,5/6NX组大鼠体重明显降低(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组大鼠体重明显升高(P<0.05),LST组大鼠体重无明显变化(P>0.05);WXT组大鼠体重明显高于LST组(P<0.05)。2肾功能相关指标比较与Sham组相比,5/6NX组大鼠Scr、BUN均明显升高(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组大鼠Scr、BUN水平明显降低(P<0.05),LST组大鼠Scr无明显变化(P>0.05),BUN明显降低(P<0.05);WXT组大鼠Scr、BUN明显低于LST组(P<0.05)。3各组大鼠24h UTP的比较与Sham组相比,5/6NX组大鼠24h UTP明显升高(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组与LST组大鼠24h UTP均明显下降(P<0.05);WXT组大鼠24h UTP较LST组低,差异有统计学意义(P<0.05)。4 TP、ALB的比较与Sham组相比,5/6NX组大鼠血TP、ALB明显降低(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组血TP、ALB明显升高(P<0.05),LST组无明显变化(P>0.05);WXT组血TP、ALB明显高于LST组(P<0.05)。5血脂的比较与Sham组相比,5/6NX组总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)均明显升高(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组TC、TG、LDL均明显下降(P<0.05),LST组无明显变化(P>0.05);WXT组TC、TG、LDL均明显低于LST组(P<0.05)。各组高密度脂蛋白(HDL)无明显差异(P>0.05)。6电解质的比较与Sham组相比,5/6NX组血清P明显升高、血清Ca明显降低(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组血清P明显降低、血清Ca明显升高(P<0.05),LST组无明显变化(P>0.05);WXT组与LST组比较,WXT组血清P明显降低、血清Ca明显升高(P<0.05)。各组大鼠血清Na、Cl、K的含量无明显差异(P>0.05)。7病理形态学改变Sham组大鼠肾脏结构正常。5/6NX组大鼠肾小球系膜细胞和基质轻中度增生,可见节段性硬化,部分肾小球缺血性皱缩;肾小管空泡颗粒变性,局灶状萎缩,肾间质局灶状纤维化伴淋巴单核细胞浸润;小动脉管壁增厚,管腔狭窄。与5/6NX组比较,WXT组及LST组肾脏损伤均有一定程度的减轻,尤以WXT组肾脏损伤减轻明显。8肾纤维化程度比较与Sham组相比,5/6NX组大鼠肾组织纤维化程度明显加重(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组及LST组纤维化程度均明显减轻(P<0.05);WXT组纤维化程度明显低于LST组(P<0.05)。第三部分温阳泄浊通络方对慢性肾衰竭大鼠肾纤维化相关蛋白的干预作用目的:观察温阳泄浊通络方对CRF大鼠肾纤维化相关蛋白转化生长因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)及纤维连接蛋白(FN)的影响,进一步探究温阳泄浊通络方对肾纤维化的干预作用。方法:大鼠造模、分组及干预方法同前。干预12周后,取血清检测TGF-β1含量,并取肾组织免疫组化法检测ColⅢ、FN的表达,免疫荧光法检测ColⅠ的表达,荧光定量实时PCR法(q PCR)检测ColⅠ及FN m RNA的表达。结果:1血清TGF-β1含量的比较与Sham组相比,5/6NX组大鼠血清TGF-β1含量明显升高(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组及LST组血清TGF-β1含量均明显降低(P<0.05);WXT组与LST组比较,无统计学差异(P>0.05)。2肾组织ColⅠ、ColⅢ及FN蛋白表达的比较与Sham组相比,5/6NX组大鼠肾组织ColⅠ、ColⅢ及FN蛋白表达明显增多;与5/6NX组相比,WXT组及LST组大鼠肾组织ColⅠ、ColⅢ及FN蛋白表达均有所降低;与LST组比较,WXT组ColⅠ、ColⅢ及FN蛋白表达明显减少。3肾组织ColⅠ及FN m RNA表达的比较与Sham组相比,5/6NX组大鼠肾组织ColⅠ及FN m RNA表达量明显升高(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组大鼠肾组织ColⅠ及FN m RNA表达量均明显降低(P<0.05),LST组肾组织ColⅠ及FN m RNA无明显变化(P>0.05);WXT组与LST组相比,WXT组肾组织ColⅠ及FN m RNA表达量明显降低(P<0.05)。第四部分基于肾小管上皮细胞EMT及Wnt/β-catenin通路探讨温阳泄浊通络方的作用机制目的:观察温阳泄浊通络方对CRF大鼠肾小管上皮细胞EMT及Wnt/β-catenin通路的影响,探讨温阳泄浊通络方改善肾功能及肾纤维化的细胞及分子机制。方法:大鼠造模、分组及干预方法同前。干预12周后,取肾组织,采用免疫组化法检测肾小管上皮细胞EMT相关蛋白(α-SMA、Vimentin、E-cadherin)的表达,western-blot法检测肾小管上皮细胞EMT相关蛋白(α-SMA、Vimentin、E-cadherin)及Wnt/β-catenin相关蛋白(Wnt4、β-catenin、TCF-4)的表达,q PCR法检测肾小管上皮细胞EMT相关蛋白(α-SMA、E-cadherin)及Wnt/β-catenin相关蛋白(Wnt4、TCF-4、β-catenin)m RNA的表达。结果:1免疫组化法检测肾组织肾小管上皮细胞EMT相关蛋白α-SMA、Vimentin、E-cadherin的表达与Sham组相比,5/6NX组大鼠肾组织α-SMA和Vimentin蛋白的表达明显增多,E-cadherin蛋白的表达明显减少;与5/6NX组相比,WXT组与LST组大鼠肾组织α-SMA和Vimentin蛋白的表达均有所减少,E-cadherin蛋白的表达有所增加。2 Western-blot法检测肾组织肾小管上皮细胞EMT相关蛋白α-SMA、Vimentin、E-cadherin的表达与Sham组相比,5/6NX组大鼠肾组织α-SMA和Vimentin蛋白的表达均明显增多(P<0.05),E-cadherin蛋白的表达明显减少(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组与LST组大鼠肾组织α-SMA和Vimentin蛋白的表达均明显减少(P<0.05),E-cadherin蛋白的表达明显增加(P<0.05)。WXT组与LST组比较,α-SMA、Vimentin、E-cadherin蛋白的表达无统计学差异(P>0.05)。3 q PCR法检测肾组织肾小管上皮细胞EMT相关蛋白α-SMA、E-cadherin m RNA的表达与Sham组相比,5/6NX组α-SMA m RNA的表达明显增多(P<0.05)、E-cadherin m RNA的表达明显减少(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组和LST组α-SMA m RNA的表达明显减少(P<0.05)、E-cadherin m RNA的表达明显增加(P<0.05);WXT组和LST组比较,α-SMA、E-cadherin m RNA的表达无统计学差异(P>0.05)。4 Western-blot法检测肾组织Wnt/β-catenin相关蛋白Wnt4、β-catenin、TCF-4蛋白的表达与Sham组相比,5/6NX组Wnt4、β-catenin、TCF-4蛋白的表达均明显增加(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组和LST组Wnt4、β-catenin、TCF-4蛋白的表达均明显下降(P<0.05);WXT组与LST组比较,WXT组Wnt4、β-catenin、TCF-4蛋白的表达低于LST组,结果有统计学意义(P<0.05)。5 q PCR法检测肾组织Wnt/β-catenin相关蛋白Wnt4、TCF-4、β-catenin m RNA的表达与Sham组相比,5/6NX组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin m RNA的表达明显增加(P<0.05);与5/6NX组相比,WXT组及LST组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin m RNA的表达无统计学差异(P>0.05)。各组TCF-4 m RNA表达无统计学差异(P>0.05)。结论:1温阳泄浊通络方可降低早中期CRF患者临床症状积分、改善肾功能、减少尿蛋白、提高疾病疗效,证实温阳泄浊通络方对早中期CRF患者具有良好的治疗效果。2温阳泄浊通络方可提高CRF大鼠肾功能、降低尿蛋白、改善肾脏病理损伤及肾纤维化程度,并具有调节营养不良、血脂及电解质紊乱的作用,效果明显优于氯沙坦,证实温阳泄浊通络方具有确切的肾脏保护作用,且在整体调节方面具有明显的优势。3温阳泄浊通络方可降低CRF大鼠纤维化相关蛋白TGF-β1、ColⅠ、ColⅢ、FN的表达,减轻肾纤维化的发生。4温阳泄浊通络方可在蛋白及基因转录水平抑制肾小管上皮细胞EMT的发生,这可能是其改善肾纤维化、保护肾功能的细胞机制之一。5温阳泄浊通络方可在蛋白水平抑制Wnt/β-catenin通路的异常激活,这可能是其改善肾纤维化、保护肾功能的分子机制之一。