目的:骨髓抑制是肿瘤化疗常见副作用之一,最先表现为白细胞减少症,诱发感染严重限制了化疗药的临床应用。临床研究发现针灸可有效改善化疗致白细胞减少症,但作用机制尚未完全阐明。本研究基于前期已建立的电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症效应平台,以交感神经修复为切入点,探讨交感神经释放垂体腺苷酸环化酶激活肽（Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP）作用于PAC1受体介导电针促进化疗后骨髓造血恢复的作用机制,并在肺癌化疗小鼠模型中验证电针改善造血功能的效应,为针刺在肿瘤化疗中“减毒增效”的作用提供科学依据,促进临床应用和推广。方法:研究内容一PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的机制研究实验一电针改善顺铂致小鼠骨髓造血功能低下的治疗效应研究复制前期效应平台,将雄性Balb/c小鼠随机分为对照组（Veh组）、化疗组（Cis组）、化疗加电针组（EA组）。化疗药顺铂剂量选用3mg/kg,一周2次,共2周。电针干预与化疗药同一天开始,选穴为双侧足三里、三阴交穴,一周3次,共2周。动态观察各组小鼠体重变化。通过对胫骨骨髓进行苏木素&伊红（Hematoxylin&Eosin,H&E）染色观察电针对化疗所致骨髓萎缩的影响。通过流式细胞术检测小鼠骨髓造血干祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs）及其亚群的数量变化,包括HSPCs、长期造血干细胞（Long-term HSCs,LT-HSCs）、短期造血干细胞（Short-term HSCs,ST-H SCs）、多能祖细胞（Multipotent progenitors,MPPs）、淋系祖细胞（Common lymphoid progenitors,CLPs）、髓系祖细胞（Common myeloid progenitors,CMPs）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（Granulocyte-macrophage progenitors,GMPs）、巨核/红系祖细胞（Megakar yocytic/erythroid progenitors,MEPs）,观察电针对化疗后骨髓造血功能的影响。实验二电针促进顺铂小鼠骨髓交感神经修复和PACAP分泌的作用研究通过胫骨骨髓交感神经纤维酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,Th）免疫荧光染色探讨交感神经分布,定量逆转录PCR（Quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR）检测骨髓内神经营养因子家族如神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）、脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）的基因含量,明确电针对化疗后骨髓交感神经损伤的修复作用。最后,通过酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测骨髓内PACAP蛋白含量,明确电针对骨髓PACAP含量的调节作用。实验三PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的机制研究在电针治疗顺铂小鼠的同时,分别给予高、低剂量PAC1拮抗剂（PACAP6-38）。首先,通过热板实验动态观察各组小鼠热痛潜伏时间的变化,明确电针及其拮抗剂对外周神经损伤的影响。其次,利用普通血常规检测外周血细胞数量（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）,观察PAC1拮抗剂对电针改善白细胞减少症的影响。最后,通过流式细胞术检测骨髓造血干祖细胞及其亚群数量,以及碘化丙啶（Propidium iodide,PI）染色观察骨髓各细胞周期（G0/G1、S、G2/M、S+G2/M）数量的变化,明确PACAP/PAC1受体介导电针改善骨髓造血的作用。实验四外源性PAC1激动剂改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用研究利用高、低剂量PAC1激动剂（PACAP1-38）干预化疗小鼠,动态观察PAC1激动剂对化疗小鼠热痛潜伏时间、外周血细胞（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）、骨髓造血干祖细胞及其亚群和细胞周期数量的变化,明确PAC1激动剂对化疗小鼠外周神经损伤、骨髓造血功能低下和白细胞减少症的影响。研究内容二电针改善顺铂致肺癌小鼠白细胞减少症的治疗效应研究实验五电针改善顺铂致肺癌小鼠白细胞减少症的治疗效应研究建立Lewis肺癌荷瘤小鼠,随机分为肿瘤组（T组）、肿瘤+化疗组（TC组）、肿瘤+化疗+电针组（EA组）,化疗药顺铂剂量选用5mg/kg,每周2次,共2周,电针干预方式同实验一。通过游标卡尺动态观察小鼠肿瘤体积,取材后检测瘤体组织重量和面积,明确电针联合化疗对肿瘤生长的影响。通过普通血常规检测外周血细胞（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）,进一步利用流式细胞术检测白细胞亚群数量（中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞）,观察电针对肺癌顺铂小鼠外周血白细胞的影响。为了进一步明确电针对肺癌顺铂小鼠骨髓造血功能的影响,通过流式细胞术检测小鼠骨髓造血干祖细胞及其亚群、细胞周期数量的变化。结果:1.电针可改善化疗导致的骨髓萎缩,提高化疗小鼠骨髓多能祖细胞（MPPs）、髓系祖细胞（CMPs）的数量。电针治疗14天可改善化疗导致的小鼠体重减轻。胫骨骨髓HE染色发现化疗后小鼠骨髓组织骨髓细胞排列稀疏,可见大量空腔,骨髓细胞密度下降,电针治疗可见骨髓细胞呈密集分布。半定量分析发现电针可增加化疗小鼠的骨髓细胞密度,具有统计学差异。流式细胞结果发现化疗导致骨髓HSPCs、MPPs、CMPs、GMPs和MEPs的数量下降,电针治疗可提高MPPs和CMPs的数量,且HSPCs的数量较化疗组升高62%,MEPs的数量升高59%,但无统计学差异。2.电针可修复化疗导致骨髓交感神经纤维退变和上调骨髓PACAP蛋白含量,可能与促进骨髓神经营养相关因子Ngf和Bdnf的基因表达有关。骨髓内交感神经纤维Th免疫荧光染色结果及半定量分析发现,化疗干预后骨髓Th阳性表达下降,电针治疗后交感神经纤维分布增多,表明电针可修复化疗导致骨髓交感神经纤维退变。化疗后骨髓内Ngf、Bdnf基因含量、PACAP蛋白含量均下降,电针治疗均可上调Ngf、Bdnf基因含量及PACAP蛋白含量。3.高剂量PAC1拮抗剂可减弱电针改善顺铂小鼠热痛迟钝,拮抗电针增加顺铂小鼠外周血白细胞、骨髓造血干祖细胞（HSPCs）、多能祖细胞（MPPs）的数量及G2/M增殖期的骨髓细胞数量的作用。电针治疗14天,化疗小鼠热痛潜伏时间明显延长,电针可缩短化疗小鼠热痛潜伏时间,高剂量PAC1拮抗剂可拮抗电针治疗作用。外周血白细胞亚群数量结果发现,化疗后小鼠白细胞和淋巴细胞数量下降,电针治疗可提高白细胞和淋巴细胞的数量,高剂量PAC1拮抗剂可拮抗电针的治疗作用。骨髓造血干祖细胞及其亚群数量结果发现,化疗干预后MPPs、CMPs和MEPs数量下降,电针治疗可提高化疗小鼠HSPCs和MPPs的数量,而高、低剂量PAC1拮抗剂使电针上升HSPCs数量的效应消失,高剂量PAC1拮抗剂小鼠MPPs的数量较电针组下降。此外,化疗可导致骨髓G2/M期细胞数量下降,相反,电针治疗可提高G2/M增殖期的细胞数量,高、低剂量PAC1拮抗剂均可拮抗电针治疗作用。4.高剂量PAC1激动剂可改善化疗导致的热痛迟钝,提高外周血白细胞、骨髓造血干祖细胞（HSPCs）、多能祖细胞（MPPs）的数量和G2/M增殖期的骨髓细胞数量。电针治疗第14天,高、低剂量PAC1激动剂可缩短化疗小鼠的热痛潜伏时间。高剂量PAC1激动剂可提高化疗小鼠白细胞数量,对淋巴细胞无改善作用。骨髓造血干祖细胞及其亚群、细胞周期结果表明,高剂量PAC1激动剂可提高化疗小鼠HSPCs的数量,高、低剂量PAC1激动剂可提高化疗小鼠MPPs和G2/M增殖期的细胞数量。5.电针联合化疗可抑制肺癌小鼠的肿瘤生长,电针治疗可提高肺癌化疗小鼠的外周血中性粒细胞数量、骨髓造血干祖细胞（HSPCs）、多能祖细胞（MPPs）、髓系祖细胞（CMPs）和巨核/红系祖细胞（MEPs）的数量,增加骨髓S增殖期的细胞数量。皮下Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤种植后第14天到第21天,与肿瘤组相比,单纯化疗与电针联合化疗治疗均可抑制肿瘤生长,且这两种干预方式均可降低瘤体重量和瘤体面积。普通血常规和流式细胞分析结果均发现,化疗导致小鼠外周血中性粒细胞下降,电针治疗可提高中性粒细胞的数量。骨髓造血干祖细胞及其亚群、细胞周期结果发现,化疗后小鼠MPPs和GMPs的数量下调,S增殖期的细胞数量下降,电针治疗可提高MPP s、HSPCs、CMPs和MEPs的数量以及S增殖期的细胞数量。电针组小鼠骨髓GMPs数量虽较化疗组小鼠升高60%,但无统计学差异。结论:1.电针可修复化疗损伤的骨髓交感神经,通过PACAP/PAC1受体促进造血干祖细胞增殖,改善顺铂致小鼠白细胞减少症。2.电针可改善肺癌小鼠化疗后骨髓造血功能低下和白细胞减少症。