研究背景和目的近年来，液体芯片飞行时间质谱技术已被广泛用于生物标志物的研究。我们采用这一技术从肝癌血清中发现一个显著差异表达的蛋白质峰，经鉴定是胸腺肽β4（Thymosinβ4，Tβ4）。已有研究资料表明，Tβ4在多种肿瘤中表达增高，与肿瘤发生、发展及转移有密切关系。然而，该小分子多肽与肝癌关系的研究尚未见报道。本课题在肝癌血清中筛查到该小分子多肽后，在较大样本验证的同时，通过多种体外实验，研究Tβ4与肝癌的关系，鉴定Tβ4促进肝癌细胞生长和转移的作用机制，为进一步建立以Tβ4为靶标的肝癌诊治新策略提供理论基础和实验依据。研究方法1、采用液体芯片飞行时间质谱技术检测肝癌血清中小分子多肽，通过TOF/TOF方法鉴定其中显著差异表达的蛋白质峰。2、采用多种实验方法检测肝癌细胞系中Tβ4表达情况。（1）免疫荧光激光共聚焦方法检测Tβ4在肝癌细胞中的表达部位。（2）Real-time PCR检测不同肝癌细胞系中Tβ4mRNA表达量。（3）流式细胞术检测不同肝癌细胞系中Tβ4表达量。3、采用ELISA方法检测正常人、慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者血清Tβ4含量。4、采用免疫组织化学方法检测临床肝癌组织Tβ4表达。5、分析肝癌组织表达Tβ4与血清Tβ4含量之间、以及与临床病理学指标之间的相关性。6、Tβ4对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力影响试验。（1）MTT法检测细胞增殖。（2）划痕法检测细胞迁移。（3）Transwell法检测细胞侵袭试验。7、Tβ4诱导肝癌细胞抵抗失巢凋亡的实验。（1）Annexin V-FITC法检测肝癌细胞经Tβ4处理后的凋亡情况。（2）Western blot分析肝癌细胞经Tβ4处理后凋亡蛋白、抗凋亡蛋白表达的变化，以及细胞存活信号通路中的关键分子ERK的磷酸化水平及核转录因子NF-κB的表达。实验结果1、液体芯片飞行时间质谱技术在肝癌血清中发现一组异常表达的蛋白质峰，通过TOF/TOF方法鉴定其中一个显著差异表达的蛋白质峰为Tβ4。2、Tβ4在肝癌细胞中表达主要位于细胞质。3、不同肝癌细胞系Tβ4表达水平存在差异。与正常肝细胞相比，7种肝癌细胞系中Tβ4表达量均不同程度地增高，尤其是高转移性肝癌细胞MHCC-97H的Tβ4表达量是正常肝细胞的2倍左右。4、分析所检测的临床肝癌标本中Tβ4的表达情况，结果显示：Tβ4的表达在肝癌组织高于与其配对的癌旁组织；肝癌组血清Tβ4含量高于正常人组、慢性肝炎组和肝硬化组（P<0.05），并且表达量在慢性肝炎-肝硬化-肝癌发展病程中呈现递增的趋势。5、相关性分析结果显示，肝癌组织Tβ4表达与配对肝癌血清Tβ4含量正相关；肝癌组织高表达Tβ4分别与血清中AFP表达量、肝癌TNM分期和血管侵袭有关（P<0.05）。6、Tβ4可以显著促进体外培养的肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力。7、Tβ4通过激活细胞内ERK发生磷酸化，提高肝癌细胞抵抗失巢凋亡的能力。研究结论液体芯片飞行时间质谱技术可用于筛查血清样本中的小分子多肽；肝癌组织和血清高表达Tβ4，可作为一个候选的肝癌标志物；其机制可能涉及增强肝癌细胞迁移、侵袭和转移能力，以及诱导肝癌细胞抵抗失巢凋亡等。有关研究结果为进一步建立以Tβ4为靶标的肝癌诊治新策略提供理论基础和实验依据。