地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是芽孢杆菌中最具应用潜力的菌种之一,被广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。地衣芽孢杆菌野生菌株的性能通常不能满足生产需要,因此需要对其进行遗传改造。将外源DNA片段成功导入地衣芽孢杆菌细胞是对宿主进行分子操作和遗传研究的前提和基础,而原生质体转化方法是芽孢杆菌遗传转化的主要手段之一。由于不同地衣芽孢杆菌菌株的原生质体形成、再生、转化差异较大,因此需要对其影响因素进行优化。地衣芽孢杆菌B. licheniformis 303是一株优良的地衣芽孢杆菌宿主菌。本论文以B. licheniformis 303为宿主,系统考察了影响该菌原生质体形成、再生的因素,初步优化了B. licheniformis 303原生质体转化方法,为进一步的分子操作奠定了基础。本文研究了B. licheniformis 303菌体生长状态、溶菌酶使用浓度和作用时间、渗透压稳定剂和再生培养基等因素对B. licheniformis 303原生质体制备及再生的影响,优化了原生质体的制备和再生条件。结果表明:以转接培养至对数生长后期即8 h的菌体,pH 6.5的SMMP作为渗透压稳定剂,溶菌酶浓度为100 mg/mL,酶解温度为37℃,摇床转速为100 r/min,酶解时间为40 min时,可获得最高原生质体制备率为8.0×109个/mL;当再生培养基DM3中添加1 mol/L琥珀酸钠时,原生质体再生率可达到17%。在此基础上,本文对影响B. licheniformis 303原生质体转化效率的主要因素进行了研究,考察了原生质体浓度、质粒浓度、Mg2+浓度、后培养方式等因素对转化率的影响。结果表明:以2μg甲基化质粒pHY-P43-secQ,40% PEG6000+20 mmol/L Mg2+为融合剂,原生质体浓度为3×109个/mL,处理5 min,后培养方式为30℃,100 r/min培养150 min,平均转化率为15 CFU/μg DNA。