研究背景干细胞(stem cells,SCs)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下,它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cell)和成体干细胞(somatic stem cell)。胚胎干细胞来源于胚胎发育期的胚泡,是一种全能干细胞,而成体干细胞则来源于已经发育成熟的组织中,是一种多能干细胞或单能干细胞。由于利用胚胎干细胞面临着复杂的伦理学问题和实际操作上的困难,对成体干细胞的研究就更具意义。目前,由于龋病或创伤导致牙髓感染和坏死的情况越来越多。治疗这些牙齿唯一的方法是根管治疗,这个方法可以去除所有感染的牙髓并用牙胶充填整个牙髓腔。但是它在治疗过程中及治疗后有很多并发症,如根管堵塞、治疗后疼痛、髓腔壁穿孔、器械折断、牙折等,这些并发症均会导致根管治疗失败,需要进一步治疗甚至拔除患牙,增加了患者的就诊时间及费用；而且根管治疗后的患牙牙冠会变色,影响美观。因此,许多学者希望可以通过组织工程学技术来使这些失去的组织再生。基于这点,学者们将注意力集中在从拔除的牙齿中提取干细胞。牙齿中的干细胞主要有牙周膜干细胞、牙髓干细胞(Dental pulpstem cells,DPSCs)和根尖牙乳头干细胞等。Gronthos等首次报道从体外培养的成人牙髓组织中获得集落状生长的细胞,该细胞可被诱导分化为成牙本质样细胞并形成牙本质样结构,由此提出了DPSCs的概念,证实牙髓组织中有干细胞群体的存在。目前,血管再生是组织工程学中的一个重要的课题,也是组织再生的先决条件,可以给再生的组织提供营养。内皮祖细胞(Endothelial precursor cells,EPCs)是从骨髓或外周血中分离出来的一种细胞。研究发现,EPCs与造血干细胞有共同的前体细胞,它参与生理或病理的新血管生成。Asahara等在1997年第一个描述了EPCs,这些细胞是来源于成体外周血或骨髓的。EPCs可由骨髓／外周血来源单个核细胞或CD34+或CD133+造血祖细胞获得,并在体外特殊的条件下分化为内皮细胞。因此,如果将hDPSCs(?)EPCs共同培养,这样在分化成成牙本质的同时也有血管为其提供营养。Waruna L Dissanayaka等将DPSCs与内皮细胞(Endothelial cells,ECs)以不同的比例共培养,其中1：1的DPSCs与ECs混合可以发现碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP),骨涎蛋白(Bone sialoprotrin,BSP)以及牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达明显增加,在培养基过程可以见到稳定的类血管结构形成,由此可以证明DPSCs与ECs共培养有促血管形成和促矿化作用。含胎牛血清的培养体系是目前干细胞的体外培养中使用最多的培养体系,而这种异种血清应用于临床治疗,可以导致过敏以及人体感染动物源性疾病的危险。富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)是从全血分离而得,可被称为“血小板浓缩物”。激活后的PRP包含很多生长因子,包括血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)、转化生长因子β(Transforming growth factor β,TGF-β)、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor,IGF),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等等。当PRP被激活后,会几乎释放这些生长因子,在之后的几天还会继续合成其它生长因子。PRP能促进组织修复,有报道PRP可以改变急性损伤后肩袖修复的生物力学和组织学特性。也有许多研究表明,PRP中生长因子的释放可以改善伤口处血管生成和增强皮肤伤口愈合。在90年代末,PRP开始应用于口腔临床研究。在口腔领域,PRP多被用来研究骨组织的再生。将PRP应用在口腔外科中,可发现其有利于减少出血和增强软组织愈合和骨再生。另一方面,由PRP释放的生物活性因子也参与合成代谢,分解代谢,促炎和抗炎过程,其中的一些因子还参与了免疫反应。因此,本实验将hDPSCs和EPCs共同培养,拟探讨其作为牙髓再生以及牙齿再生的可能性,进而用同种的PRP来替代异种的血清来培养细胞,并向成牙本质和成血管方向诱导,观察其对成牙本质分化及血管生成的影响；还可以通过研究PRP的促成牙本质和促血管生成作用,探讨其作为组织工程中异种血清的替代品的应用前景,从而为组织工程牙髓再生的研究及其临床应用提供实验依据。材料与方法第一章：hDPSCs和EPCs的分离培养及鉴定取临床上年龄在19-25岁之间因正畸或阻生需要拔除的健康完整牙齿,用组织块预消化法分离培养hDPSCs。待细胞长满瓶底约80%-90%时传代扩大培养。体外鉴定hDPSCs,取第三代细胞,流式细胞仪检测CD90、CD44及CD29三个表面标记物。并将细胞体外向成脂、成软骨及成骨方向诱导进一步鉴定细胞。在南方医科大学南方医院产科签订知情同意书后,采血袋收集健康志愿者脐带血,用密度梯度离心法分离培养EPCs,待细胞出现克隆样生长时,扩大培养。体外鉴定EPCs,取第五代细胞,流式细胞仪检测CD31、 CD105、 CD45、 CD14. CD34、CD133、 CD117、CD146及KDR这几个表面标记物。第二章：PRP的制备激活及其对hDPSCs/EPCs及其共培养物增殖的影响取健康志愿者捐献的脐带血,无菌条件下,二次离心法制备PRP,并用血细胞分析仪检测PRP和全血中血小板的数量。每毫升PRP加入两个单位肝素,用反复冻融方法激活。将hDPSCs、EPCs及其共培养物分别接种于96孔板,分为六组,包括EPCs+10%FBS(EF),EPCs+10%PRP(EP),hDPSCs+10%FBS(DF),hDPSCs+10%PRP (DP),hDPSCs+EPCs+10%FBS(DEF),hDPSCs+EPCs+10%PRP(DEP),分别在1d,3d,5d,7d和9d后,用MTT法检测各孔490波长时的OD值来观察PRP对两种细胞及其共培养物增殖方面的影响。第三章：PRP对hDPSCs/EPCs及其共培养物成牙本质的影响取第3-5代hDPSCs和第5-7代EPCs,分为四组(DF, DP,DEF和DEP),接种在六孔板中,共培养的比例为1：1。细胞增殖至80%时,更换为矿化诱导液,诱导7d和14d后,用qRT-PCR方法检测ALP,DMP-1及DSPP的表达情况。第四章：PRP对hDPSCs/EPCs及其共培养物成血管的影响取第3-5代hDPSCs和第5-7代EPCs,分为四组(EF,EP, EDF和EDP),接种在六孔板中,共培养的比例为1：1。细胞增殖至80%时,向成血管方向诱导,诱导3d,7d和14d后,用qRT-PCR方法检测VEGF,PDGF,Flk-l和SDF-1在mRNA水平上的表达情况。进而用Wesern blot的方法检测VEGF在蛋白水平上的表达情况。用Tube formation的方法检测PRP对细胞形成血管样结构的影响,并用ImageJ2X软件来计算管状面积的百分比,公式为每组管状结构的面积/24孔板的单孔面积×100%。细胞共分为三组,包括EPCs+10%FBS,EPCs+10%PRP和EPCs+hDPSCs+10%FBS,24孔板按照产品说明预先涂布Matrigel后,接种2×1O5EPCs(共培组接种1×105),孵育24h后在共培组中加入hDPSCs(共培比例1：1)。48h后,用2μM的钙黄绿素进行染色。在7到48h期间,用倒置显微镜拍摄照片。统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,结果以均值±标准差表示,采用One-Way ANOVA检验进行显著性分析,设立检验水准α=0.05。结果1.成功分离培养hDPSCs和EPCs本实验利用组织块预消化法成功分离培养hDPSCs,所获得细胞具有成骨、成脂、成软骨能力,流式细胞检测其细胞表面标记物,CD29、 CD44、 CD90(间充质干细胞标记物)阳性表达率分别为88.19%、99.58%、99.51%。实验中细胞取材于人牙髓组织,具有多向分化潜能、且为间充质来源,为hDPSCs。本实验利用密度梯度离心法成功分离培养EPCs,流式细胞检测其细胞表面标记物,CD31和CD105(内皮细胞标记物)阳性表达率分别为99.82%和98.91%；CD45和CD14(造血细胞标记物)阳性表达率分别为0.06%和1.1%；CD34、CD133和CD117(干细胞标记物)阳性表达率分别为7.51%、0%和1.69%；以CD105阳性设门检测CD146和KDR两个内皮细胞标记物的阳性率为100%和92.11%。实验中细胞取材于人脐带血,具有克隆形成能力,且高表达内皮细胞标记物及低表达造血细胞和干细胞标记物,证明其为EPCs。2.成功制备PRP本实验利用二次分离法制备PRP,得到PRP中血小板含量为1306-1949×109/L,全血中为116-230×109/L,且两者之间有统计学意义(P<0.01)。血小板在PRP中的含量是全血中的五倍以上,证明其为PRP。3.PRP对hDPSCs/EPCs及其共培养物增殖的影响MTT结果显示,hDPSCs在3d开始进入对数生长期,7d后进入平台期,而EPCs在3d进入对数生长期后,未见明显的平台期。DF和DP组在增殖5d时两组之间有显著的统计学差异(P<0.01)；在增殖的9d,EF和EP组及DEF和DEP组之间有明显的统计学差异(P<0.05)。4.PRP对hDPSCs/EPCs及其共培养物成牙本质的影响经过矿化诱导后7d和14d,qRT-PCR显示ALP,DMP-1及DSPP三个因子的表达情况趋势基本一样,并且可发现在DP,DEF及DEP三个组中的表达均比DE组高,PRP组比FBS组高,共培养组比单培养组高,且这些结果均有统计学意义(P<0.05)。5.PRP对hDPSCs/EPCs及其共培养物成血管的影响经过成血管诱导后3d,7d和14d后,qRT-PCR显示VEGF,PDGF,Flk-1和SDF-1的表达趋势基本一样。在3d,四个因子在共培组的表达水平均比单培组高(P<0.05),除了SDF-1外的三个因子在PRP组的表达水平较FBS组高(P<0.05)。在7d和14d,四个因子在共培组/PRP组均比在单培组/FBS组表达高(P<0.01)。Western blot显示3,7和14dVEGF在蛋白水平上的表达情况在EP,EDF和EDP组比EF组有升高的趋势。其中PRP组较FBS组,共培组较单培组均有升高的趋势。Tube formation显示在接种7h后开始形成类血管结构,而且含有PRP的可形成更完整的结构。48h后,PRP组形成的类血管结构面积百分比为67%±1.8%,而FBS组为63%±0.17%,两者之间具有统计学意义(P<0.05)。共培养组与单培养组相比,可以更好的维持类血管结构多达38h。结论1.利用组织块预消化法成功分离培养hDPSCs,所获得的细胞具有间充质干细胞表型与生物特性,证实为hDPSCs；利用密度梯度离心法成功分离培养EPCs,所获得的细胞具有内皮细胞表型与生物特性,证实为EPCs。2.利用二次离心法成功制备了PRP,并证实了其含血小板量是全血的5倍以上。3.PRP能够维持细胞的生存与共存,并且有一定的促进增殖的作用。4.成牙本质及成血管分化诱导后,PRP有明显的促进分化的作用,将细胞共培养不但可以维持分化,并且也有一定的促进作用。