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睾丸是雄性哺乳动物产生精子和雄激素的器官,性成熟前睾丸体细胞的增殖与功能成熟对睾丸结构的形成以及精子发生均具有重要的意义。DNA甲基化(DNA methylation)是建立和维持基因组表观遗传状态的基础,在睾丸发育过程中发挥着一定的调控作用。猪作为主要的经济动物和理想的模式动物,具有重要的研究价值,然而目前关于出生后到性成熟前这一阶段猪睾丸基因组甲基化的研究却很少。因此,为了探究性成熟前猪睾丸组织中DNA甲基化的变化特征,本文选取1、2、3月龄三个时间点的猪睾丸实质组织,利用MeDIP-seq的方法成功构建了性成熟前猪睾丸全基因组DNA甲基化图谱,研究该发育阶段猪睾丸基因组甲基化变化以及相关功能基因的甲基化情况。本研究共计获得约19.04 Gb高质量测序数据,将超过190 M的clean reads比对到猪基因组上,平均比对率为82.94%。我们发现随着发育时间推进,基因组DNA甲基化水平整体呈现出下降的趋势,启动子(promoter)甲基化水平也表现出降低的趋势,而Gene body的甲基化水平变化不大;另外,3月龄的平均甲基化水平明显低于1、2月龄(P<0.01),而1、2月龄间平均甲基化水平的差异不显著(P>0.05)。该结果表明猪睾丸发育中DNA甲基化的变化是广泛且动态的,并且逐渐降低的甲基化水平在性成熟前睾丸发育过程中具有一定的调控作用。通过对差异甲基化区域(DMRs)的鉴定和功能富集分析发现,1、3月龄间鉴定得到最多的DMRs(3931个),2、3月龄间次之(1599个),1、2月龄间最少(1534个);DMRs的甲基化水平也整体呈现出下降的趋势。差异甲基化基因显著富集与细胞增殖,能量代谢,类固醇、胆固醇的合成与代谢,视黄醇的代谢,氧化应激负调控等相关功能及通路中(Q-value<0.05),表明性成熟前这一阶段的发育在猪睾丸细胞增殖、结构形成、功能成熟中发挥重要的作用;其中富集到的PPAR信号通路和TGF-β信号通路在睾丸体细胞的发育中发挥一定调控作用。从全基因组DNA甲基化图谱中比对得到8个猪印记基因的甲基化状态:DIRAS3、IGF2、IGF2R、MEST、NAP1L5、NNAT、PEG10以及PLAGL1,发现它们的甲基化程度均不高,表现为“非甲基化”或“部分甲基化”,提示这8个印记基因在性成熟前猪睾丸发育过程中均具一定活性。NAAT、PLAGL1启动子甲基化水平在1到3月龄之间保持增长,NAPIL5、IGF2R启动子甲基化水平在1到2月龄下降,2到3月龄增长,DIRAS3、IGF2、MEST、PEG10启动子甲基化水平在1到2月龄增长,2到3月龄下降;图谱中仅比对到其中4个基因的Gene body甲基化状态,IGF2R、MEST Gene body甲基化水平在1到3月龄保持下降,PLAGL1、PEG10 Gene body甲基化水平在1到2月龄增长,2到3月龄下降。以上结果提示DNA甲基化对印记基因发挥一定的调控作用。本文研究结果揭示了性成熟前猪睾丸基因组DNA甲基化呈现动态变化,甲基化水平表现出下降趋势,为明确DNA甲基化对性成熟前猪睾丸发育的调控机制提供了一定的科学依据,有利于我们深入探索哺乳动物睾丸发育及精子发生,并为遗传育种研究和治疗雄性不育等方面拓展新的思路。