蛋白质和DNA等生物大分子是生命活动的重要化学基础,生物分子构象多种多样,且能与其它分子以不同结合状态存在。常规物质分析技术仅从宏观了解物质属性,而对单个分子及分子间的相互作用不能进行准确、有效表达。近十年发展起来的高灵敏单分子检测手段不仅能对单个分子进行观察和鉴定,而且为生物大分子的结构和功能作用研究提供直接信息,可用于研究传统分析方法及生物学方法难以解决的问题,为分子生物学、化学和医学的更深层次上的研究提供一种新的分析手段。其中,基于纳米通道检测技术建立的高效、快速单分子检测方法,越来越为分析科学家们所关注。纳米通道是以具有孔状结构的α-溶血素(α-Hemolysin)蛋白在仿生界面磷脂双层膜上形成生物纳米通道为基础,利用通道中离子流变化在单分子水平上对生物大分子的结构进行研究。许多疾病的发生均与蛋白质结构变化相关,本文以此为出发点,利用具有前庭结构的小孔径α-溶血素纳米通道探究神经退行性疾病致病纤维蛋白的空间结构和聚集状态变化,为神经退行性疾病的早期诊断和药物筛选提供了新方法。开发出具有对称结构的大孔径生物纳米通道SP1(Stable Protein),在单分子水平上分析DNA分子形态变化,为DNA链与对称型生物纳米通道内部作用研究提供新的研究模型,有望扩展现有生物纳米通道成孔材料的应用范围。具体研究内容如下：1、a-溶血素生物纳米通道用于阿兹海默症(Alzheimer Disease, AD)致病蛋白(Aβ42)结构变化研究利用α-溶血素纳米通道单分子检测装置及控制分析系统,在电场驱动下实时观察Aβ42单体及其寡聚物在纳米通道中的结构变化信息。经分析寡聚物被纳米通道捕获时的阻断电流值约为96.58±0.20pA,阻断时间长达数秒,表明Aβ42单体自聚集形成寡聚物能够被纳米通道所捕获。加入小分子药物调控后,发现常用淀粉样蛋白染色剂刚果红可抑制Aβ42的聚集,形成结构较小的单体,单体穿过纳米通道产生的特征阻断电流值约为25.47±0.30pA。常用药物包裹剂p-环糊精能够促进Aβ42的快速聚集,形成较大体积聚集物而无法进入纳米通道。通过纳米通道可在单分子水平上观察Aβ42经小分子药物作用后结构变化,为AD的早期诊断及药物筛选提供了新方法。2、α-溶血素生物纳米通道对帕金森症(Parkinson Disease, PD)致病蛋白聚集行为研究通过α-溶血素纳米通道在单分子水平上对PD致病蛋白α-synuclein纤维化行为进行研究。野生型和突变型α-synuclein均为研究对象,在体外生理环境下,α-synuclein单体C端带有负电且为伸展状态,在电场驱动下能够以线性从纳米通道负极端运动至正极端。外加电压大于100mV时,较强电场作用可改变α-synuclein单体分子内静电作用,使其形成部分折叠的中间态被α-溶血素前庭捕获,使阻断电流降低至约20.0±1.0pA,该中间体进一步折叠使阻塞电流降低至约5.0±0.5pA。而不断降低电压可使分子间静电作用减弱,折叠趋势逐渐减小,当电压小于40mV时,折叠分子可退出通道入口处,由此,我们通过纳米通道检测手段在单分子水平上证明α-syn纤维化的初始阶段存在部分折叠的结构变化中间体。同一体系中,引入还原型海藻糖分子,证明其对突变型蛋白(A53T α-synuclein)聚集具有抑制作用而对野生型蛋白聚集无抑制作用,由此推断海藻糖对突变型α-synuclein的抑聚集是通过改变β-叠片表面水层张力而破坏分子间氢键作用,这对临床上PD的早期治疗和早预防具有一定启示意义。3、基于稳定蛋白(Stable Protein One, SP1)纳米通道对DNA结构分析SP1蛋白经简易操作即可在磷脂双层膜上形成内径约为3nm的纳米通道,通道电导约为1.5nS。将其应用于区分不同结构和链长的单链DNA,证明含有同样碱基的单链DNA分子,刚性链状结构分了穿过通道时间与链长成正比,结构较为松散的非链状结构分子则不遵守此规则。同等实验条件下,相同单链DNA通过α-溶血素纳米通道的速率约为SP1纳米通道的2-4倍,表明SP1纳米通道以其较短的通道长度和没有前庭的圆柱体状结构在核酸序列检测中能够减缓DNA链穿过的速率,有望成为用于新一代基因测序的天然成孔材料,并用于其他生物大分子单分子水平检测,极大地扩宽了现有生物纳米成孔材料的应用范围。