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一、研究背景:
白癜风是一种病因不明的局部皮肤色素明显减退或消失的皮肤病,目前研究资料表明,白癜风皮损中黑素细胞(melanocyte,MC)减少或者消失的机制之一可能为细胞凋亡<[1-3]>。本实验对白癜风患者MC进行体外培养,用UVC诱导凋亡,同时对细胞凋亡调通路上两组关键因子Bcl-2/Bax、Fas/FasL在MC的表达进行测定,探讨细胞凋亡在白癜风发病机制中的作用。
二、研究目的:
1、对白癜风患者进行MC培养,观察寻常型稳定期白癜风患者白斑区、白斑边缘区、及非白斑区表皮MC的生长情况。
2、检测白癜风患者MC的凋亡率及凋亡相关因子(Bcl-2、Bax、Fas、FasL)的表达,探讨白癜风患者MC凋亡与凋亡相关因子的关系。
3、采用UVC诱导MC凋亡,观察其凋亡相关因子(Bcl-2、Bax、Fas、FasL)的表达,探讨白癜风患者MC对调亡诱导因素可能的耐受机制。
三、实验对象和方法:
1、标本来源:
实验组取寻常型稳定期白癜风患者白斑区、白斑边缘区、及非白斑区皮肤,对照组取健康者正常皮肤,进行组织病理检查及表皮MC的体外培养。
2、细胞培养、观察:
将皮肤标本修剪后用消化液消化分离得到表皮,制成表皮单细胞悬液,接种于黑素细胞培养基。在倒置显微镜下观察两组细胞形态及生长情况,待细胞长到约90﹪满时,进行消化、传代。取第6~8代细胞进行细胞活力、凋亡率及凋亡因子的测定。
3、细胞活力及凋亡率测定:
用MTT法测定细胞活力;用Annexin-V和Propidium Iodide(PI)标记后,FCM检测MC的凋亡率。
4、凋亡相关因子(Bcl-2、Bax、Fas、FasL)测定:
体外培养的白癜风组及正常组MC各基因mRNA水平的表达用逆转录PCR(RT-PCR)法进行检测,蛋白水平表达用免疫组化、SABC法检测。
5、UVC诱导细胞凋亡:
分别用36J/m<2>、72J/m<2>、108J/m<2>剂量的UVC(波长峰值为254nm)对实验组和对照组MC进行照射,24h后用流式细胞仪双标法测定细胞凋亡率。
6、UVC诱导细胞凋亡相关因子表达的检测:
用RT-PCR法检测体外培养的白癜风组及正常组MC经UVC照射后各基因的转录水平。
7、统计学处理:
采用SPSS统计软件包对实验数据进行独立样本t检验分析,显著性水准设为0.05。
四、实验结果:
1、组织病理结果:
白癜风患者白斑区表皮基底层黑色素减少或消失,MC减少,白斑边缘黑色素增多,白斑、白斑边缘及非白斑区真皮浅层均可见程度不一的单一核细胞浸润;正常组则无异常。
2、细胞培养及凋亡测定结果
(1)MC生长情况:白癜风白斑组培养无细胞贴壁,未见细胞生长(见附照片5);白斑边缘组有少数多树突细胞贴壁,但细胞生长增殖不良,未能进行传代(见附照片6);白癜风非白斑区组及正常组标本接种后有较多梭形或多角形细胞贴壁,树突数多为2~5个,生长增殖良好(见附照片7)。用二羟基苯丙酸(多巴)染色进行鉴定,可见胞浆及树突呈棕褐色,证实为MC(见附照片8)。以下实验中所用细胞为第6~8代白癜风非白斑区组及正常组MC。
(2)MC活力及凋亡率测定结果 MTT法测定白癜风非白斑区组MC细胞活力较正常组MC减低(P<0.35):FCM检测MC凋亡率较正常对照组增高(P<0.05)。
(3)凋亡相关因子表达测定结果与正常组MC比较,白癜风非白斑区组Bcl-2转录、翻译水平均升高(P<0.05);Bax因子转录、翻译水平均降低(P<0.05);Fas、FasL因子的转录、翻译水平均稍有升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。
3、UVC诱导MC凋亡结果
(1)在相同剂量UVC诱导下,白癜风非白斑区组MC凋亡时间前移,总凋亡率明显高于正常对照组(P<0.01=。
(2)UVC诱导MC凋亡相关因子表达的测定结果:与UVC照射前比较,正常组MC照射后的Bcl-2转录增加(P<0.05=,Bax转录减少(P<0.05=;白癜风组非白斑区MC的Bcl-2、Bax基因UVC照射前后转录水平无显著变化(P>0.05);正常组及白癜风非白斑区组经UVC照射后的Fas、FasL转录水平均较照射前升高,其中白癜风非白斑区组升高趋势更为明显,但2组照射前后差异均无统计学意义(P>0.05)。
五、结论:
1、白癜风患者白斑区、白斑边缘区及非白斑区均存在不同程度的MC破坏,体外培养时,白斑区无MC生长,白斑边缘区MC生长不良,非白斑区MC生长及增殖能力减低;
2、体外培养的白癜风患者非白斑区MC活力下降、凋亡率增加,可能与凋亡相关因子Fas、FasL表达上调有关;
3、UVC照射后,白癜风患者非白斑区MC凋亡率明显增高,表明白癜风患者MC抗凋亡能力明显下降,可能与其UVC照射后Bcl-2低表达、Fas高表达有关。
4、白癜风患者MC减少或消失与MC凋亡异常有关。