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研究背景及目的:特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种以普通型间质性肺炎(usual interstitial pneumonitis,UIP)为特征性病理改变的慢性、弥漫性肺间质病变的疾病,其临床表现主要为进行性呼吸困难和刺激性干咳,预后不良,诊断后的中位生存时间为3-5年。大部分患者因肺纤维化导致肺动脉高压、呼吸困难、肺源性心脏病和右心衰竭死亡。IPF目前还缺乏特异有效的治疗手段。糖皮质激素仍作为首选药物广泛用于临床,但其疗效不确切,且副作用大。因此研究IPF治疗具有非常重要的意义。冬虫夏草是我国有两千多年历史的传统药用真菌,有显著的抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗炎、免疫调节等功效。冬虫夏草临床效果虽然明显,但由于产量有限,不能被广泛应用。蝙蝠蛾被毛孢、中华束丝孢、中国被毛孢为同物异名,且为冬虫夏草菌的无性型菌种。本研究采用的人工冬虫夏草(百令胶囊)是采用生物工程方法分离冬虫夏草后低温发酵精制而成的,是以中华束丝孢为生产菌种,与天然冬虫夏草有相似的化学成份。目前已初步证实人工冬虫夏草在肾间质纤维化、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病动物模型有一定的干预作用。人工冬虫夏草对实验性肺纤维化动物模型的干预作用也已经有了初步的探讨,作用机制可能是通过抑制TGF-β1在肺组织中的表达,调整Ⅰ型/Ⅱ型细胞因子平衡达到的,但国内外尚未有人工冬虫夏草对肺纤维化早期肺泡炎阶段作用的研究。且从IPF的发病进程、临床症状发展迅速的特点及现有人工冬虫夏草的研究来看,人工冬虫夏草单独治疗肺纤维化仍缺乏有力的证据,仍需糖皮质激素控制IPF症状。目前国内外也尚未有研究报道人工冬虫夏草联合糖皮质激素对肺纤维化的治疗作用。故本实验分三部分研究,第一部分:人工冬虫夏草对肺纤维化的干预作用;第二部分:分别从肺泡炎阶段及肺纤维化阶段探讨人工冬虫夏草对大鼠肺纤维化的作用机制;第三部分:人工冬虫夏草联合糖皮质激素对肺纤维化的治疗作用。第一部分人工冬虫夏草对博莱霉素所致大鼠肺纤维化的干预作用目的探讨人工冬虫夏草对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的干预作用。方法40只SD大鼠,随机分为4组:①正常对照组(Ctr组);②模型组(Blm组);③虫草菌液组(Ccs组);④强的松组(Pred组)。采用气管内注射博莱霉素建立模型,次日起分别给予虫草菌液5 g·kg-1·d-1、强的松6mg·kg-1·d-1灌胃治疗,Ctr组和Blm组给予生理盐水灌胃。实验期间观察大鼠一般状况及称体重。第28d处死动物,肺组织标本行HE染色病理形态学观察及Ashcroft纤维化评分,肺组织MASSON染色测量胶原面积,碱水解法检测肺组织HYP含量。结果Ctr组大鼠一般状况佳,28d后体重较造模前增长(175.4±16.3)g,肺组织结构清晰,无明显纤维组织增生,纤维化评分为0.54±0.23,血管及气道壁少量绿色胶原沉积,胶原相对面积为(6.8±0.95)%,肺组织HYP含量为(2053.67±197)μg/g;与Ctr组比较,Blm组大鼠一般状况差,体重增长量(104.5±23.2g)明显减少(P<0.01),肺组织结构破坏,重度炎性细胞浸润,大块纤维组织增生实变,纤维化评分(5.83±1.21)明显增高(P<0.01),支气管、血管周边及肺间质大量绿色胶原沉积,胶原相对面积(67.83±16.23%)增加(P<0.01) ,肺组织HYP含量(4693.76±386μg/g)明显升高(P<0.01);与Blm组相比,Ccs组大鼠一般状况改善,体重增长量(173.6±12.6 g)增加(P<0.05),Ccs组可见肺组织损害减轻,纤维组织增生减少,纤维化评分(3.25±0.43)降低(P<0.01),胶原面积(35.22±11.34%)减少(P<0.01),肺组织HYP含量(3812.92±240μg/g)减少(P<0.05)。与Blm组相比,Pred组大鼠一般状况及体重增长量(125.9±16.7 g)无明显改善,Pred组可见肺组织损害减轻,纤维组织增生减少,纤维化评分(3.48±0.91)降低(P<0.01),胶原面积(31.48±8.65%)减少(P<0.01),肺组织HYP含量(3792.02±207μg/g)减少(P<0.05)。结论人工冬虫夏草能够减轻博莱霉素所致大鼠肺纤维化,改善大鼠一般状况。第二部分人工冬虫夏草对大鼠肺纤维化作用机制的初步探讨目的探讨人工冬虫夏草对大鼠肺纤维化干预作用的机制。方法80只SD大鼠,随机分为14d组和28d组。14d组分为:①正常对照组(Ctrl4d组);②模型组(Blm14d组);③强的松(Pred14d组);④人工冬虫夏草组(Ccs14d组)。28d组分为:①正常对照组(Ctr28d组);②模型组(Blm28d组);③人工冬虫夏草组(Ccs28d组);④强的松(Pred28d组)。采用气管内注射博莱霉素建立模型,次日起Ccs28d组、Pred28d组分别给予虫草菌液5 g·kg-1·d-1、强的松6mg·kg-1·d-1灌胃治疗,Ctrl4d组、Ctr28d组、Blm14d组和Blm28d组分别给予生理盐水灌胃。14d组于14d处死动物,肺组织标本进行病理形态学观察及肺泡炎评分,免疫组化检测肺组织iNOS表达,ELISA法检测BALF TNF-α、GSH、MDA含量及SOD活性;28d组于28d处死动物,ELISA法检测BALF TGF-β1含量,免疫组化检测肺组织CTGF蛋白表达。结果Ctr14d组肺组织结构清晰,无炎性细胞浸润,肺泡炎评分为0.25±0.10;与Ctr14d组相比,Blm14d组可见肺组织结构破坏,重度炎性细胞浸润以及纤维组织增生实变,肺泡炎评分(2.5±0.42)明显升高(P<0.01),BALF中TNF-α、MDA含量明显升高,SOD活力、GSH含量降低,肺组织iNOS表达明显上调(P均<0.01);与Blm14d组相比,Ccs14d组、Pred14d组肺组织损害减轻,炎性细胞浸润以及纤维组织增生明显减少,肺泡炎评分分别为1.5±0.16、1.37±0.14,均明显降低(P均<0.01),BALF中TNF-α、MDA含量降低(P均<0.01),GSH含量及SOD活力升高(P均<0.01),肺组织iNOS表达下调(P均<0.01)。与Ctr28d组相比,Blm28d组BLAF中TGF-β1的含量明显升高,CTGF蛋白表达上调(P均<0.01);与Blm28d组相比,Ccs28d组、Pred28d组能够降低BALF中TGF-β1的含量(P<0.05),下调肺组织CTGF蛋白表达(P<0.05)。结论(1)人工冬虫夏草对博莱霉素所致肺纤维化早期肺泡炎阶段的干预作用,可能是通过下调BALF中TNF-α、肺组织iNOS等细胞因子的表达、减少脂质过氧化物的释放,达到减轻肺泡炎的作用。(2)人工冬虫夏草对博莱霉素所致肺纤维化阶段的干预作用,可能是通过减少BALF含量,下调CTGF表达,达到减轻肺纤维化的作用。(3)人工冬虫夏草对肺纤维化干预作用的机制,可能是通过肺泡炎阶段下调炎症介质及过氧化物表达,抑制炎症及氧化损伤对肺纤维阶段TGF-β1的活化,下调CTGF表达减少CTGF与TGF-β1结合,达到抑制ECM合成、减轻肺纤维化的作用。第三部分人工冬虫夏草联合糖皮质激素对大鼠肺纤维化的干预作用目的人工冬虫夏草联合糖皮质激素对大鼠肺纤维化的干预作用。方法105只SD大鼠随机分7组:①正常对照组(Ctr组);②模型组(Blm组);③虫草菌液组(Ccs组);④常规剂量强的松组(C-Pred组);⑤小剂量强的松组(L-Pred组);⑥常规剂量强的松联合虫草菌液组(C-Com组);⑦小剂量强的松联合虫草菌液组(L-Com组)。采用气管内注射博莱霉素建立模型,次日起分别给药灌胃治疗,Ctr组和Blm组给予生理盐水灌胃。于第28d处死动物,肺组织标本行HE染色及Ashcroft纤维化评分,肺组织MASSON染色测量胶原面积,碱水解法检测肺组织HYP含量,免疫组化检测肺组织TGF-β1蛋白表达,蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测肺组织PDGF-BB蛋白表达,ELISA法检测肺泡灌洗液上清bFGF含量。结果Ctr组大鼠一般状况佳,体重增长量为(184.4±19.4)g;与Ctr组比较,Blm组大鼠一般状况差,体重增长量(119.5±28.6g)明显减少(P<0.01);与Blm组相比,C-Pred组一般状况无明显改善,体重增长量(128.72±21.9g)无统计学差异(P>0.05);其余各治疗组大鼠一般状况改善,体重增长量增加(P<0.01),其中C-Com组(P<0.05)。Ctr组肺组织结构清晰,无明显纤维组织增生,纤维化评分为0.61±0.43,血管及气道壁少量绿色胶原纤维沉积,胶原面积为(9.41±1.86)%;与Ctr组相比,Blm组可见肺组织结构破坏,重度炎性细胞浸润,大块纤维组织增生实变,纤维化评分(4.63±1.21)升高(P<0.01),支气管、血管周边及肺间质大量绿色胶原沉积,胶原面积(69.63±7.09)增加(P<0.01),肺组织HYP含量升高(P<0.01),TGF-β1蛋白、PDGF-BB蛋白表达上调(P均<0.01),BLAF中bFGF含量升高(P<0.01);与Blm组相比,Ccs组、C-Pred组可见纤维组织增生减少,纤维化评分降低(P均<0.05),胶原面积减少(P均<0.05),HYP含量下降(P均<0.01),TGF-β1蛋白表达下调(P<0.01),PDGF-BB蛋白表达下调(P<0.05),Ccs组bFGF含量降低(P<0.01),C-Pred组bFGF含量无明显改变(P>0.05);C-Com组分别与Ccs组、C-Pred组比较,能够进一步降低肺纤维化评分,进一步减少胶原面积,降低HYP含量、bFGF含量,下调TGF-β1蛋白、PDGF-BB蛋白表达(P均<0.05),L-Com组分别与Ccs组、L-Pred组比较,能够进一步降低肺纤维化评分,进一步减少胶原面积,降低HYP含量、bFGF含量,下调TGF-β1蛋白(P均<0.05),其中PDGF-BB蛋白表达与Ccs组比较,无统计学差异(P>0.05)。结论(1)人工冬虫夏草联合强的松对博莱霉素所致肺纤维化有协同治疗作用,并能改善大鼠一般状况。(2)人工冬虫夏草联合强的松对肺纤维化协同治疗作用的机制,可能是通过协同抑制TGF-β1、bFGF、PDGF-BB等促细胞外基质(ECM)合成因子,达到协同减轻肺纤维化的作用。(3)小剂量强的松联合人工冬虫夏草与常规剂量强的松联合人工冬虫夏草对肺纤维化的治疗作用相同。