肺动脉高压(Pulmonary artery hypertension,PAH)是一种进行性的肺血管与心脏结构功能异常的病理生理综合征。尽管肺血管损害是PAH原发病变,然而患者的临床预后主要取决于右心室的功能状态。目前,临床上PAH的药物主要为抑制肺血管平滑肌细胞增殖与肺血管收缩,此类药物能降低肺动脉压、缓解PAH患者的症状与改善生活质量,但并不能有效逆转患者右心室功能状态与临床预后。临床上对右心室重构机制及药物治疗的认识均源于左心室。遗憾的是,PAH右心室重构可能存在与压力负荷左心室并不完全相同的机制,因此大部分治疗左心衰的药物对右心衰并无效果。深入研究PAH右室重构的细胞和分子机制为PAH治疗药物筛选,开发右室特异性药物、逆转右室重构,从而改善患者预后具有重要的科学意义及临床价值。自噬是一种酵母至哺乳动物进化过程中形成的,通过细胞内双层膜结构的自噬体包裹细胞成份,并与溶酶体相溶合、从而形成自噬溶酶体,籍此降解与再循环长寿命蛋白与细胞器的生命活动过程。目前证实,自噬与细胞存亡调控存在密切关系,参与了多种结构性心脏病心脏重构。右室心肌缺血、缺氧是PAH右室重构重要的病理生理基础。磷酸腺苷活化的蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)与缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,Hif1-α)/腺病毒E1B 19 k Da蛋白相互作用蛋白3(Adenovirus E1B 19-k Da interacting protein 3,BNIP3)/Beclin-1是缺氧条件下细胞自噬激活的两条重要信号通路。但PAH右室重构过程中右室心肌细胞自噬时序性变化?以上两条信号通路是否参与PAH右室心肌自噬调控?不同信号通路激活自噬对心肌细胞的作用如何?尚未阐明。本课题在建立野百合碱(Monocrotaline,MCT)诱导PAH大鼠模型及缺氧培养大鼠心肌细胞模型的基础上,通过以下三部分的实验,初步探讨PAH右心室重构发展过程中心肌自噬变化规律、可能调控机制及其生物学作用。该研究结果将为PAH治疗药物筛选,开发右室特异性自噬调控药物、防治PAH右室重构与功能异常提供初步理论依据与实验基础。第一部分野百合碱诱导肺动脉高压大鼠模型建立及右室心肌缺氧相关指标变化。目的:建立野百合碱诱导PAH大鼠模型,观察PAH大鼠右室结构、功能变化;并探讨PAH大鼠右室心肌细胞缺氧相关指标变化。方法:60只8周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为MCT组(n=36)及对照组(n=24)。两组动物均设2、4、6周3个时点亚组;MCT组每个时点亚组12只,对照组每个时点亚组8只。采用经项背部皮下注射MCT(60mg/kg)建立肺动脉高压模型(MCT组),对照组(CON组)注射等量生理盐水。实验终点对存活大鼠行超声心动图检查,测量右室结构与功能参数;右心导管检测肺动脉收缩压(Pulmonary artery systolic pressure,PASP)、肺动脉平均压(Pulmonary artery mean pressure,PAMP);测量右室肥厚指数;苏木精—伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色了解肺血管及右室心肌组织病理改变,测量肺血管阻塞率,心肌细胞直径,Masson染色检测心肌胶原含量。麦胚凝集素染色(Wheat germ agglutinin staining,WGA)检测右室心肌细胞面积大小;CD31免疫荧光染色检测心肌毛细血管生成;用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)、免疫组化与蛋白质印迹(Western blot)检测心肌肌红蛋白(myoglobin)的m RNA与蛋白表达。结果:与对照组相比,MCT大鼠PASP、PAMP均显著增高,以6周组为著。MCT大鼠2周时右室心肌轻度肥厚、右室收缩功能维持正常;4周右室扩大,心室明显肥厚、收缩功能轻度减低;6周时右室显著扩大重构、心功能显著降低并出现右心衰症状。组织病理学上,MCT大鼠肺动脉血管阻塞率较对照组增高并持续增加;2周始右室心肌细胞直径及面积轻度增大,4周与6周最为显著。MCT大鼠2周亚组右室心肌胶原含量与对照组无显著差异,而4与6周亚组MCT显著增多。与对照组相比,MCT大鼠的2周亚组心肌毛细血管数目、myoglobin的m RNA及蛋白表达差异无统计学意义,而4周与6周亚组则显著降低。结论:MCT成功构建PAH大鼠模型,复制PAH右室重构的发展过程。MCT大鼠2周出现右室心肌细胞肥大;而4周及6周时心肌细胞持续增大、毛细血管减少与心肌myoglobin水平降低诱导右室心肌缺血、缺氧是PAH右室重构的重要病理生理基础。第二部分肺动脉高压大鼠右室心肌细胞自噬变化及可能的调控通路目的:探讨PAH大鼠右室重构过程中,右室心肌细胞自噬时序性变化规律及其与肺动脉收缩压的关系;阐明缺氧相关自噬信号通路在PAH大鼠右室心肌自噬的调控作用。方法:动物造模与分组同第一部分。RT-q PCR检测右室与左室心肌自噬标志蛋白-微管相关轻链蛋白3(Microtubule associated light chain protein 3,LC3)m RNA水平;免疫组化及Western blot检测LC3蛋白表达;western blot检测自噬体降解标志蛋白P62表达;透射电镜观察右室心肌细胞自噬体形态与数目。Western blot检测右室心肌AMPK/m TOR及Hif-1α/BNIP3/Beclin-1缺氧通路的关键蛋白p-AMPK,AMPK,p-m TOR,m TOR,p-p70S6K,p70S6K以及Hif-1α,BNIP3,Beclin-1,Bcl2的表达水平。结果:与对照组相比,MCT大鼠右室心肌LC3,LC3-II/LC3-I比值及于2,4,6周持续上调表达,而P62则下调表达;透射电镜显示右室心肌细胞内自噬体持续增多;相反,对照组各时点亚组LC3,LC3-II/LC3-I比及P62差异无统计学意义,心肌细胞内自噬体少见。此外,MCT及对照组大鼠的各时点亚组左室心肌LC3,LC3-II/LC3-I及P62差异均无统计学意义。右室心肌LC3蛋白水平与增高的肺动脉收缩压呈显著正相关(r2=0.626,P<0.01)。与对照组相比,p-AMPK蛋白于2周至4周上调表达,而在6周时下调表达;相反,p-m TOR则表现为2周至4周下调,而在6周时上调表达;各时点AMPK,m TOR及p70S6K蛋白表达差异无统计学意义。然而,与对照组相比,BNIP3、Beclin-1蛋白于2周至4周呈较低水平表达,而6周时显著上调,Hif-1α与BNIP3变化趋势不完全一致,于4周达峰值,6周稍下降。此外,MCT大鼠右室心肌Bcl2于2周时达到峰值,4周至6周依次降低。对照组各时点亚组右室心肌相关蛋白表达差异均无统计学意义。结论:PAH右室心肌持续激活自噬与增高的肺动脉收缩压呈显著正相关关系。AMPK/m TOR及BNIP3/Beclin-1缺氧相关自噬信号通路可能参与了PAH右室自噬调控;2周至4周自噬激活主要通过AMPK/m TOR通路,而6周时则主要为BNIP3/Beclin-1通路依赖,BNIP3的活化不完全受Hif-1α所调控。第三部分AMPK/m TOR及BNIP3/Beclin-1通路调控自噬对缺氧心肌细胞的影响目的:通过研究AMPK/m TOR和BNIP3/Beclin-1调控自噬对缺氧心肌细胞影响;结合第二部分研究,进一步揭示不同通路激活自噬对PAH右室重构的作用。方法:(1)将一组大鼠心肌细胞株H9C2细胞分为常氧组、缺氧组(2天)、缺氧+AMPK抑制剂(Compound C)组、缺氧+AMPK激活剂(AICAR)组共四亚组;western blot检测心肌细胞p-AMPK,AMPK,p-m TOR,m TOR通路关键蛋白表达;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)荧光染色观察心肌自噬体,western blot检测LC3蛋白表达水平;在bafilomycin A1处理缺氧及缺氧+AICAR心肌细胞的基础上,再次通过MDC荧光染色观察自噬体,western blot检测LC3蛋白表达水平;WGA荧光染色显示心肌细胞大小,RT-q PCR检测心房钠尿肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)与B型脑钠肽(Type B natriuretic peptide,BNP)的m RNA表达;CCK8法检测心肌细胞存活率;流式细胞术检测心肌细胞凋亡。将另一组心肌细胞分为缺氧组、缺氧+AICAR组、缺氧+AICAR+3-MA组;MDC荧光染色观察心肌自噬小体,Western blot检测LC3蛋白表达水平;CCK8法检测心肌细胞存活率;流式细胞术检测心肌细胞凋亡。(2)将一组心肌细胞分为常氧组、缺氧组(4天)、阴性对照组,缺氧+BNIP3-RNAi干扰组,缺氧+LV-BNIP3过表达共五亚组;Western blot检测心肌细胞BNIP3及Beclin-1通路关键蛋白表达水平;MDC荧光染色检测心肌细胞自噬小体,Western blot检测LC3蛋白表达水平;CCK8法检测心肌细胞存活率;流式细胞术检测心肌细胞凋亡。在bafilomycin A1处理缺氧及缺氧+LV-BNIP3过表达心肌细胞的基础上,再次通过MDC荧光染色观察自噬体,western blot检测LC3蛋白表达水平。将另一组心肌细胞分为缺氧组、缺氧+阴性对照组、缺氧+LV-BNIP3过表达组、缺氧+BNIP3过表达+3-MA组;MDC荧光染色观察心肌自噬小体,Western blot检测LC3蛋白表达水平;CCK8法检测心肌细胞存活率;流式细胞术检测心肌细胞凋亡。结果:(1)与常氧组相比,缺氧组p-AMPK/AMPK上调表达,而p-m TOR/m TOR下调表达;MDC荧光强度增高,LC3-II/LC3-I比值上调表达;心肌细胞存活率下降,而凋亡率增高。与缺氧组相比,Compound C干预组p-AMPK/AMPK下调表达,而p-m TOR/m TOR上调表达;MDC荧光强度降低,LC3-II/LC3-I比值下调表达;心肌细胞存活率降低;凋亡率显著增高。相反,AICAR干预组p-AMPK/AMPK上调表达,而p-m TOR/m TOR下调;MDC荧光强度增强,LC3-II/LC3-I比值增高;心肌细胞存活率增高;凋亡率显著降低。各组心肌细胞大小及ANP、BNP m RNA表达水平差异无统计学意义。经bafilomycin A1处理后,缺氧及缺氧+AICAR干预组心肌细胞MDC荧光强度及LC3-II/LC3-I显著增加。与缺氧+AICAR组相比,缺氧+AICAR+3-MA组心肌细胞MDC荧光强度降低,LC3-II/LC3-I比值下调表达;心肌细胞存活率降低;凋亡率显著增高。(2)与常氧组相比,缺氧组BNIP3及Beclin-1上调表达;MDC荧光强度增强,LC3-II/LC3-I比值上调表达,心肌细胞存活率下降,凋亡率增加。与缺氧组相比,BNIP3-RNAi干扰组的BNIP3及Beclin-1下调表达,MDC荧光强度减低,LC3-II/LC3-I比值下调表达;心肌细胞存活率增加,凋亡率降低;相反,LV-BNIP3过表达组BNIP3及Beclin-1上调表达,MDC荧光强度增强,LC3-II/LC3-I比值上调表达;心肌细胞存活率降低,凋亡率增高。阴性对照组与缺氧培养组各检测指标差异无统计学意义。经bafilomycin A1处理后,缺氧及缺氧+LV-BNIP3过表达组心肌细胞MDC荧光强度及LC3-II/LC3-I显著增加。与未经3-MA处理缺氧+LV-BNIP3过表达组相比,经3-MA处理的缺氧+LV-BNIP3过表达心肌细胞MDC荧光强度减低,LC3-II/LC3-I比值下调表达;心肌细胞存活率增加;而凋亡率差异无统计学意义。结论:缺氧条件下,AMPK/m TOR通路通过自噬激活发挥促心肌细胞存活(包括凋亡抑制),而对心肌细胞大小无显著影响;BNIP3/Beclin-1通路通过调控自噬水平促进心肌细胞死亡。