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鼻咽癌是我国高发肿瘤,国内外研究证明EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein1,LMP1)在其发生发展中起重要作用,被认为是鼻咽癌的致癌基因。RNA干扰(RNA interference,RNAi)和脱氧核酶(deoxyribozyme,DNAzyme,DZ)技术是能够有效抑制目的基因表达的两种基因治疗策略,已被广泛应用于目的基因功能研究和肿瘤及病毒的基因治疗中。本研究针对EBV-LMP1 mRNA设计、构建表达小发卡状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的重组表达载体(pshRNA-LMP1),观察pshRNA-LMP1在鼻咽癌细胞内抑制EBV-LMP1基因表达的效率及对鼻咽癌细胞产生的生物学影响,以及联合脱氧核酶抑制EBV-LMP1基因表达的效应,为鼻咽癌的预防和临床治疗提供新的基因治疗策略。目的:设计构建针对绿色荧光蛋白(GFP)小发卡状RNA表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中对绿色荧光蛋白表达的抑制作用,证实shRNA表达载体诱导的RNA干扰技术在鼻咽癌细胞株中沉默目标基因表达的可行性。方法:增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染鼻咽癌HNE1细胞并予G418筛选稳定表达GFP的细胞克隆(HNE1-GFP);设计构建针对GFP的小发卡状RNA表达载体(pshRNA-GFP);观察不同浓度pshRNA-GFP抑制HNE1-GFP靶基因mRNA、蛋白表达情况及细胞毒性大小。结果: pshRNA-GFP能够显著抑制鼻咽癌细胞中GFP基因mRNA和蛋白水平的表达且无细胞毒性;pshRNA-GFP1:3和2:5浓度级别组有较高的抑制效率。结论:特异性小发卡状RNA能够有效抑制鼻咽癌细胞内源性GFP的表达,表明shRNA表达载体介导的RNA干扰在鼻咽癌细胞株中抑制目标基因表达具有可行性。目的:构建EBV-LMP1绿色荧光融合蛋白真核表达载体,观察绿色荧光融合蛋白在鼻咽癌细胞的表达情况,为利用该荧光可视化细胞系统筛选高效特异的pshRNA-LMP1建立细胞平台。方法:从B95-8细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增EBV-LMP1 cDNA片段,构建重组T载体pMD18-T-LMP1m。以重组T载体为模板,构建LMP1绿色荧光融合蛋白真核表达载体pEGFP-N1-LMP1m、pEGFP-C1-LMP1m、pEGFP-N1-LMP1a、pEGFP-C1-LMP1c。在鼻咽癌HNE1细胞中观察融合蛋白荧光表达情况,RT-PCR及western blot鉴定融合蛋白在HNE1细胞中的表达。结果:成功构建pEGFP-N1-LMP1m、pEGFP-C1-LMP1m、pEGFP-N1-LMP1a、pEGFP-C1-LMP1c真核表达重组载体,转染HNE1细胞后可见荧光融合蛋白的表达,RT-PCR和western blot证实LMP1融合蛋白表达成功。结论:在鼻咽癌HNE1细胞中实现了LMP1蛋白的N端、C端及全长蛋白表达,成功建立了EBV-LMP1相关荧光可视化细胞平台,为进一步进行EBV-LMP1靶向小干扰RNA的荧光可视化筛选奠定了基础。目的:构建并筛选高效特异抑制鼻咽癌细胞内EBV-LMP1基因表达的靶向小发卡状RNA表达载体(pshRNA-LMP1),并观察其在鼻咽癌细胞内产生的生物学效应。方法:设计构建5个pshRNA-LMP1。优化重组质粒pEGFP-N1-LMP1m和pshRNA-LMP1共转染HNE1细胞的条件。观察pshRNA-LMP1抑制荧光融合蛋白表达的高效性和特异性,RT-PCR及Western Blot检测LMP1mRNA和蛋白表达,MTT检测细胞增值活力、AO/EB检测细胞凋亡、流式检测荧光抑制率。结果:成功构建5个LMP1靶向小发卡状RNA表达载体: pshRNA-LMP1-130/318/3521/3519/3519c。pEGFP-N1-LMP1m与pshRNA-LMP1共转染HNE1细胞的最佳比例为0.5μg:1.0μg。筛选出pshRNA-LMP1-3519具有最佳特异性和高效性且无细胞毒性,能有效降低LMP1mRNA和蛋白质表达水平,并能抑制HNE1细胞的生长及促进细胞凋亡。结论:利用荧光可视化的细胞平台,构建并筛选出高效特异的EBV-LMP1靶向shRNA表达载体pshRNA-LMP1-3519,证实了其在鼻咽癌细胞中的对靶基因沉默作用,及其促进鼻咽癌细胞的凋亡和抑制鼻咽癌细胞的生长的作用。为进一步应用RNA干扰技术抑制鼻咽癌增殖生长等动物实验提供了实验基础。目的:观察小发卡状RNA联合脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞中EBV-LMP1基因表达的协同作用,为进一步进行动物及临床试验提供实验依据。方法:pshRNA-LMP1-3519联合前期实验证实能在鼻咽癌细胞中有效抑制EBV-LMP1表达的脱氧核酶DZ167和DZ509,与重组载体pEGFP-N1-LMP1m共转染HNE1细胞,流式检测荧光抑制率、RT-PCR和Western Blot分别检测EBV-LMP1基因mRNA和蛋白表达。结果:荧光表达抑制率分别为pshRNA-LMP1-3519单独干扰组75.15% ; pshRNA-LMP1-3519联合DZ167干预组86.31% ; pshRNA-LMP1-3519联合DZ509干预组88.88%,流式检测绿色荧光表达率pshRNA-LMP1-3519单独干扰组12.99%,联合干预组5.60%;RT-PCR和Western Blot均证实pshRNA-LMP1-3519联合DZ167/509干预组能更有效降低EBV-LMP1基因mRNA和蛋白表达。结论:小发卡状RNA联合脱氧核酶较各自单独应用时可提高抑制EBV-LMP1基因表达的效率。表明RNA干扰和脱氧核酶技术的联合应用可提高目标基因的抑制效率,为鼻咽癌的基因治疗提供了一种新的策略。