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瘤胃酸中毒是反刍动物生产中常见的一种营养代谢疾病,给养殖业带来巨大的损失。瘤胃酸中毒会引起瘤胃屏障结构破坏、功能丧失,增加瘤胃内有毒物质进入血液的途径,进而加重病症引发全身性代谢型酸中毒,但其发生机制尚不清楚,有待深入研究。有研究发现,瘤胃屏障结构的破坏可能与瘤胃上皮细胞过度凋亡有关。高浓度乳酸是引起急性瘤胃酸中毒发生的主要因素。但乳酸是否能诱导瘤胃上皮细胞凋亡还未见报道。烟酸是一种B族维生素,在缓解瘤胃酸中毒症状上有一定效果,但烟酸对瘤胃上皮细胞凋亡是否具有保护作用尚不清楚。本试验采用成年湖羊瘤胃上皮细胞作为试验对象,通过体外培养法研究乳酸及烟酸对瘤胃上皮细胞细胞活力、氧化还原状态、线粒体膜电位、凋亡及相关基因和蛋白的影响,探讨乳酸及烟酸对瘤胃上皮细胞凋亡的调控机制。通过MTT法检测细胞活力,Annexin V FITC/PI双染法检测细胞凋亡,荧光显微镜观察线粒体膜电位变化,流式细胞术测定细胞内活性氧及线粒体膜电位变化,实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹试验分析细胞内凋亡相关基因及蛋白的相对表达水平。试验结果如下:(1)不同剂量抗生素处理对成年湖羊瘤胃上皮细胞原代培养结果的影响。通过用含有不同剂量抗生素的PBS涮洗瘤胃上皮组织块,进行瘤胃上皮细胞原代培养前的微生物去除,选择最适宜的条件。试验结果显示,通过第II组(含有5倍青链霉素+5倍庆大两性霉素B的PBS)涮洗的瘤胃上皮组织,可以获得较为纯净的组织块,且分离得到的瘤胃上皮原代细胞生长及贴壁情况都较好。通过绘制瘤胃上皮传一代细胞7天的生长曲线,发现细胞生长呈典型的“S”型生长。(2)乳酸及烟酸对瘤胃上皮细胞活力的影响。添加不同浓度(0、100、200、300、400、500 mmol/L)乳酸处理瘤胃上皮细胞不同时间(3、6、12、24 h),检测乳酸对瘤胃上皮细胞相对活力的影响。结果显示,低浓度(100 mmol/L)乳酸能增加细胞相对活力,而高浓度(200~500 mmol/L)乳酸降低细胞相对活力,对细胞生长具有抑制作用。根据以上结果,本试验选择300 mmol/L乳酸处理24 h进行后续的试验。在培养基中添加300 mmol/L乳酸的同时添加不同浓度(0、20、40、80、160、320 mmol/L)烟酸处理细胞24 h,探讨烟酸对乳酸引起的细胞损伤的保护作用。结果显示,20~80mmol/L烟酸能缓解乳酸引起的细胞损伤,增加细胞活力,促进细胞生长。其中,40mmol/L烟酸效果最显著。160 mmol/L和320 mmol/L烟酸对乳酸引起的细胞损伤没有保护作用,反而降低细胞活力,具有一定的细胞毒性。然后将试验分为3组,基础培养基处理的瘤胃上皮细胞为对照组,300 mmol/L乳酸处理24 h的瘤胃上皮细胞为乳酸组,300 mmol/L乳酸+40 mmol/L烟酸处理24 h的瘤胃上皮细胞作为乳酸+烟酸组,每个组设3个复孔,进行后续试验。(3)乳酸及添加烟酸对瘤胃上皮细胞氧化还原状态及线粒体膜电位的影响。ROS及T-AOC检测结果表明,与对照组相比,乳酸组细胞内ROS含量增加(P<0.05),T-AOC降低(P<0.05);与乳酸组相比,乳酸+烟酸组细胞内ROS的产生减少(P<0.05),提高细胞抗氧化能力(P<0.05);线粒体膜电位检测结果显示,与对照组相比,乳酸处理使线粒体膜电位丧失(P<0.05),线粒体膜结构损伤增加;与乳酸组相比,添加烟酸能升高线粒体膜电位(P<0.05),缓解乳酸引起的线粒体损伤。(4)乳酸及添加烟酸对瘤胃上皮细胞凋亡及相关基因和蛋白的影响。流式结果表明,与对照组相比,300 mmol/L乳酸处理细胞24 h能减少晚凋细胞数,增加早凋细胞数,增加细胞凋亡指数(P<0.05),诱导瘤胃上皮细胞凋亡;与乳酸组相比,添加40 mmol/L烟酸能有效降低早凋和晚凋细胞数,减少凋亡指数(P<0.05),缓解细胞凋亡,对乳酸引起的细胞损伤具有保护作用。基因及蛋白试验结果表明,乳酸组较对照组上调了Mct1、p53、PARP-1、Cyt-C、AIF、caspase-9、Fas、caspase-8、caspase-3基因及蛋白的表达(P<0.05),上调了Bax的基因表达水平(P<0.05),对Bcl-2基因表达及Bcl-2/Bax基因表达比值均无显著影响(P>0.05),显著降低了Bcl-2蛋白的表达(P<0.05),对Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax蛋白表达比值无显著差异(P>0.05)。而乳酸+烟酸组较乳酸组显著降低了Mct1、p53、PARP-1、Bax、Cyt-C、AIF、caspase-9、Fas、caspase-8、caspase-3基因及蛋白的表达(P<0.05),下调了Bcl-2基因表达(P<0.05),对Bcl-2/Bax基因表达比值无显著影响(P>0.05),显著上调了Bcl-2蛋白的表达及Bcl-2/Bax蛋白表达比值(P<0.05)。综合上述结果表明,300 mmol/L乳酸引起瘤胃上皮细胞内ROS含量上升,抗氧化能力下降,线粒体膜电位丧失,Mct1、p53、PARP-1、Cyt-C、AIF、caspase-9、Fas、caspase-8、caspase-3基因及蛋白表达增加,对Bcl-2/Bax的比值无影响,诱导细胞凋亡。而添加40 mmol/L烟酸能显著抑制上述事件的发生,上调Bcl-2/Bax蛋白表达比值。因此,高浓度乳酸诱导瘤胃上皮细胞凋亡可能是通过正反馈Mct1浓度增加,促进乳酸向胞内运输,增加细胞内氧化应激,损伤线粒体膜结构和DNA,激活不依赖Bcl蛋白的内源途径和外源途径引起的。添加一定浓度的烟酸可以缓解高浓度乳酸引起的瘤胃上皮细胞凋亡,其机制可能是通过提高细胞内抗氧化水平,缓解细胞内线粒体膜损伤,修复DNA损伤,进而阻止下游凋亡相关因子的激活而对细胞凋亡起到保护作用。