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目的:肺癌已成为当今世界发病率与死亡率增长最快且严重危害人类健康与生命的恶性肿瘤之一,而非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在肺癌中占很高的比例,且发病率逐年上升,因此,对NSCLC的研究显得尤为重要。现在人们普遍认为,肿瘤的发生是一个多基因参与、多阶段、多步骤的复杂的生物学过程,其中最主要的一个阶段就是抑癌基因的失活。近年来,一个新的抑癌基因 LKB1,又称 STK11(serine/threonine proteinkinase11),在肿瘤中的作用引起了极大的关注。已证实,LKB1可参与细胞内多种生物活动,在控制和调节细胞能量、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞极性中发挥着重要的作用。许多研究表明,LKB1基因的体细胞突变在散发性肿瘤中是罕见的,但在NSCLC中突变率却高达35%,因此针对LKB1信号通路的研究,将为NSCLC的治疗带来希望。目前对于LKB1的信号传导通路了解的并不多,其中比较明确的信号传导通路是LKBl-AMPK-mTOR。mTOR是LKB1下游最关键的调节靶点之一,LKB1的突变失活可以导致mTOR信号通路的异常活化。许多研究表明mTOR传导通路的异常活化与肺癌的发生发展密切相关。因此,mTOR抑制剂已成为抗NSCLC药物靶向治疗上的一个理想目标。现已有4种mTOR抑制剂有效的应用于临床。本研究将探讨mTOR抑制剂作用于LKB1背景不同的细胞株后,通过检测相关蛋白的表达水平及对细胞生长增殖的影响,进一步揭示mTOR抑制剂的作用机理及与LKB1基因的相关性。方法:1、培养NSCLC细胞株A549、H460、H1792及Calul,收集并裂解细胞,经Western Blot方法检测LKB1背景不同的细胞株mTOR下游相关蛋白p-S6K和p-4EBP1的基础表达水平。2、应用10nm/L的Rapamycin处理LKB1背景不同的肺癌细胞株A549、H460、H1792及Calul,作用2h,各自有空白对照,比较mTOR下游靶蛋白p-4EBP1表达水平的差异。3、培养NSCLC细胞株A549、H460、H1792、H1299及Calu1,应用不同浓度Rad001、Rapamycin(0、0.1nm/L、1nm/L、10nm/L、100nm/L、1000nm/L)处理上述细胞株,作用72h,经MTS与SRB两种实验方法检测Rad001、Rapamycin(两种药物均为mTOR抑制剂)对肺癌细胞株的毒性作用;培养同源细胞系H1299-PLK0.1 和 H1299-LKB1shRNA,应用不同浓度(0、0.1nm/L、1nm/L、10nm/L、100nm/L、1000nm/L)Rapamycin 处理,重复上述实验。4、应用 10nm/L 的 Rad001 处理细胞株 A549、H460、H1792 及 Calu1,作用 2h,各自有空白对照,比较P-AKT表达水平的差异。5、应用 10um/L 的 LY 与 10nm/L 的 Rad001 联合处理 A549、H1792,作用 2h,各自有空白对照,比较P-AKT表达水平的差异;同时进行细胞毒性实验。结果:1、p-S6K和p-4EBP1的表达水平在LKB1突变型细胞株(A549、H460)中较LKB1野生型细胞株(H1792、Calu1)中明显升高。2、在LKB1背景不同的肺癌细胞株中(A549、H460、H1792、Calu1),应用Rapamycin 10nm/L处理2h后,p-4EBP1的表达水平较空白对照组均下降。3、应用不同浓度的 Rad001、Rapamycin 处理 A549、H460、H1792、H1299 及Calu1,作用72h后,经MTS方法检测结果示:随着药物浓度的增加,Rad001、Rapamycin对各细胞系的生长抑制率均<40%,细胞毒性在LKB1背景不同的细胞株间无明显差异;经SRB方法检测结果示:Rad001、Rapamycin对各种细胞株的生长抑制率均<30%,细胞毒性在LKB1背景不同的细胞株间无明显差异;应用不同浓度的Rapamycin处理同源细胞系H1299-PLK0.1和H1299-LKB1shRNA,作用72h后,经MTS方法检测结果示,随着药物浓度的增加,raparmycin对上述2种细胞株的生长抑制率均<10%,且抑制率间无明显差异,与以上结果相同。4、在A549、H460、H1792及Calu1肺癌细胞株中,应用Rad00110nm/L处理2h后,P-AKT表达水平较空白对照组明显上调。5、在A549、H1792肺癌细胞株中,应用10um/L LY与10nm/L Rad001联合应用后,P-AKT表达水平较Rad001 1Onm/L 单药应用明显下调。同时在细胞毒性实验中,细胞抑制率联合用药较单药使用高。结论:1、LKB1-AMPK-mTOR信号传导通路在LKB1突变型NSCLC细胞株中处于活化状态,且rmTOR抑制剂能抑制下游信号通路的传导。2、mTOR抑制剂对NSCLC细胞株的毒性作用均很弱,且与LKB1基因突变无相关性。3、mTOR抑制剂作用于NSCLC细胞株后可反馈激活P-AKT的表达,其也许是NSCLC细胞株对mTOR抑制剂不敏感的原因之一。4、PI3K抑制剂与mTOR抑制剂联合使用后,前者可以部分抵消后者对P-AKT的反馈激活;细胞毒性试验表现为很好的协同作用。