非洲爪蟾白细胞介素8及γ-IFN诱导的溶酶体巯基还原酶的克隆、表达及生物学活性研究

来源 :南京师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:SQUIRRELXX
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第一部分非洲爪蟾白细胞介素8Interleukin-8(IL-8)的研究。本研究成功克隆了非洲爪蟾的白细胞介素8并进行了鉴定。其编码框由312个碱基组成,可以编码含有103个氨基酸的蛋白质。非洲爪蟾的IL-8含有Glu-Leu-Arg(ELR)及四个保守的半胱氨酸,属于趋化因子中CXC家族。荧光定量PCR结果显示非洲爪蟾的白细胞介素8在脾脏和肾脏中高表达。非洲爪蟾的单核细胞受LPS刺激后6小时IL-8的表达量达到最高水准。通过采用与SUMO融合表达的方法,由BL21菌中通过Ni亲和层析制备到大量可溶重组IL-8并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫转印检测(Western blotting)鉴定。
  趋化实验结果显示无论是与SUMO融合的IL-8蛋白还是单独的IL-8蛋白只对淋巴细胞发挥作用,而对单核细胞没有作用。第二部分非洲爪蟾γ-IFN诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)的研究。
  非洲爪蟾GILT的cDNA序列包含一个771bp的编码框,编码一个由256个氨基酸组成的28.76KDa的蛋白质。其N-端包含一个15个氨基酸组成的信号肽。SMART分析发现X1GILT包含一个C69GGC72的活性位点及14QHGKEECIGNLIETC129的特征序列。组织定量分析显示X1GILT的mRNA在脾脏中含量最高,而肺中表达量最低。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了带有His6标签的重组可溶性GILT(XlsGILT),并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫转印检测鉴定。
  XlsGILT具有还原完整免疫球蛋白G(IgG)内部二硫键的活性,这些为非洲爪蟾作为一种模式生物来研究GILT在MHCⅡ抗原呈递过程中的二硫键还原中起的重要作用提供了可能。
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