研究背景与目的青光眼(glaucoma)造成永久性视神经伤害,严重损害视觉视功能,是迄今位于全球首位的不可逆性致盲眼病。青光眼的病理特征是病理性眼压升高,视神经的凹陷性萎缩,导致发生进行性视野缺损。但目前关于青光眼的发病机制尚未阐明。目前认为其发病可能与机械压迫损伤学说以及缺血学说有关。青光眼发病过程的重要危险因素是病理性眼压升高,目前对青光眼治疗的主要方法是利用药物治疗或手术治疗降低眼压,从而减缓青光眼的疾病发生发展进程。但在临床工作中发现,部分青光眼患者的眼压虽可降低至正常范围内,但仍未阻断视神经萎缩的进展,且视功能也持续性减退,因此应用药物治疗或其他干预措施对视神经的保护治疗,抑制视网膜神经节细胞凋亡,或增加视网膜神经节细胞存活数目,延长其存活时间,是维持青光眼患者的视力,阻止视功能损伤的关键措施。视神经的形成主要是由从视网膜各个方向延伸到视乳头的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)的轴突纤维而形成,视神经的视网膜神经节细胞向视觉中枢传递视觉信号,因此RGCs凋亡是青光眼等眼科疾病的重要病理特征之一。因此研究青光眼等视神经损害疾病的发病机制主要围绕RGCs细胞。对于视网膜神经节细胞的损伤机制研究认为可能有包括剥夺神经营养因子、兴奋性氨基酸毒性、钙超载、以及氧自由基损伤等。而建立RGC-5细胞系并制备相关细胞凋亡模型是研究视网膜神经节细胞的损伤机制的关键。高度保守的基因调节因子microRNA(miRNA)的出现为疾病诊断、治疗提供新的思路。miRNA主要以序列特异性的方式,通过转录后调控发挥作用,调节基因表达,对转录后水平的基因表达起抑制作用,参与细胞生长、增殖、分化、代谢及凋亡的调控。miRNA一般由19-25个核苷酸组成,长度为18-22 nt,前体微小RNA由Drosha酶切割成70nt左右的发夹状前体,是几百至几千nt大小的初级产物,由RNA聚合酶Ⅱ转录产生,pre-miRNA是miRNA的前身,转运至细胞质,由RNA酶Ⅲ内切酶家族的Dicer酶剪切前体微小RNA形成,从各自的pre-RNA的5’端释放出来,成为18-22 nt的成熟的单链miRNA,发挥对靶mRNA降解或阻遏其转录后翻译的作用。研究发现microRNA与视网膜病变的发生、发展密切相关。miRNAs可能与视网膜色素变性、视神经母细胞瘤以及视网膜新生血管化等都有关。microRNA-100(miR-100)是新近研究的MicroRNA成员,目前已发现其主要与肿瘤的发生、发展关系密切。目前已发现miR-100在肝癌、肺癌、鼻咽癌、肾上腺皮质肿瘤等多种肿瘤中表达异常,促进肿瘤的发生或侵袭。但miR-100在青光眼等眼科疾病中的表达及其具体作用机制尚未完全阐明,因此本研究的目的是探讨miR-100在RGC-5细胞凋亡发生的作用及机制。研究方法：1、培养RGC-5细胞,分别加入不同浓度100μm、200μm、400μm、500μm、 1000μm过氧化氢培养24h,制备氧化应激损伤模型；MTT法和TUNEL法检测RGC-5细胞凋亡情况；使用Real time PCR检测miR-100在正常和不同浓度(100 u、200μm、400μm、500μm、1000μm)过氧化氢氧化应激损伤模型中的表达。2、选取400μm浓度过氧化氢制作氧化应激模型,利用慢病毒转染miR-100抑制剂,检测抑制miR-100后对RGC-5细胞凋亡情况的保护作用；MTT法和TUNEL染色观察细胞凋亡情况；并用免疫组化分析抑制miR-100后对氧化应激损伤的RGC-5轴突长度的影响。3、Western blot分析miR-100对RGC-5细胞的作用机制；使用荧光素酶活性实验检测miR-100与GIF1R基因3’UTR的靶向调节作用；使用siRNA转染IGF1R蛋白后,用TUNEL法检测RGC-5细胞凋亡情况；使用Western blot分析上述过程。结果：1、过氧化氢所造成的氧化应激损伤,使RGC-5细胞的凋亡率显著增加,与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；且过氧化氢造成的氧化应激损伤导致的RGC-5细胞的凋亡率具有浓度依赖性。不论是正常RGC-5细胞还是氧化应激损伤的细胞模型中,均可检测到miR-100的表达。但在正常RGC-5细胞中,miR-100含量非常少,而与正常细胞的miR-100表达比较,可见不同浓度过氧化氢作用的RGC-5细胞中miR-100均呈表达上调,与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),且随着过氧化氢作用浓度的增加,RGC-5细胞中miR-100表达进一步增加。2、转染miR-100抑制剂后,可显著降低氧化应激损伤的RGC-5细胞中miR-100的表达,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。氧化损伤模型中,在转染miR-100抑制剂有效抑制miR-100表达后,RGC-5细胞中TUNEL染色阳性细胞明显减少,RGC-5细胞凋亡率明显降低,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染miR-100抑制剂后,因氧化应激损伤导致变圆肿胀的细胞变得细长,形态与正常RGC-5细胞相似,RGC-5细胞轴突长度明显增加,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、转染miR-100抑制剂后,磷酸化的TrkB、磷酸化的AKT、磷酸化的ERK1/2蛋白表达增加,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。miR-100靶向结合IGF1R的3’UTR, IGF1R3’UTR荧光素活性明显降低,且这种活性降低主要见于野生型IGF1R,突变型IGF1R并未见明显变化,与对照组以及突变型IGF1R比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。siRNA干扰IGF1R后,使IGF1R表达减少或抑制,RGC-5 TUNEL染色阳性的细胞明显减少,其磷酸化的AKT表达增加。结论：1.过氧化氢作用RGC-5细胞造成氧化应激损伤,可诱导RGC-5细胞凋亡,且呈浓度依赖性。2.miR-100在正常和氧化应激损伤的RGC-5细胞中均表达,且随着氧化应激损伤程度增加而表达上调,呈浓度依赖性,说明与RGC-5细胞凋亡相关。3.下调miR-100可抑制RGC-5细胞凋亡,对RGC-5细胞起保护作用。下调miR-100的表达可能通过激活TrkB/AKT/ERK通路发挥调节RGC-5细胞凋亡及对RGC-5细胞的保护作用。4.下调miR-100的表达,可能是通过调节其靶基因IGF1R的表达,从而激活TrkB/AKT/ERK通路,减少氧化应激后RGC-5细胞凋亡,发挥对RGC-5细胞的保护作用。