肥胖是由机体能量代谢紊乱引起的白色脂肪组织在体内积聚过多而导致的营养障碍性疾病。肥胖的危害巨大,是2型糖尿病、心血管疾病、高血压、脂肪肝及部分恶性肿瘤等疾病发生的重要因素,不仅严重威胁个人健康,也给家庭和社会造成巨大经济损失。棕色脂肪组织(Brown adipose tissue,BAT)具备将脂肪以热能消耗掉这一独特而强大的代谢能力。此外棕色脂肪组织的活性与体重、BMI呈负相关,因此通过激活体内棕色脂肪活性成为肥胖治疗研究领域最具前景的突破口。micro RNA(miRNA)是一类重要的小非编码RNAs(21-24核苷酸),广泛参与不同的生物学过程,在转录后水平负反馈调节基因表达。近年,miRNA在脂肪细胞分化及产热中扮演重要的角色,而且其表达受到环境因素(寒冷)、药物(如肾上腺素受体激动剂、PPARγ激动剂等)、激素(如BMP7、T3等)等多种因素的调控,如此复杂的调控网络有效地维持着机体脂肪组织的内分泌稳态。目前,尽管多个miRNA(miR-133a、miR-196a、miR-155等)被报道能作为关键因子对棕色脂肪功能进行调控,但是仍不足以完整阐释miRNA调控棕色脂肪功能的机制,进一步寻找新的miRNA填补现有制的空缺、构建更为完善的调控网络,将对肥胖的治疗提供有力的支持。为进一步挖掘寒冷因素调控的miRNAs,我们采用miRNA测序技术(miRNA Sequencing)筛选寒冷刺激前后小鼠BAT中差异表达的miRNAs,结果显示:82条miRNA差异表达于寒冷刺激下的小鼠BAT(|fold change|≥1,P<0.05),其中38条高表达于寒冷刺激后的BAT,44条低表达于寒冷刺激后的BAT。依据信号值大、组内差异小的原则,我们选择20条miRNA进行q PCR验证,结果与测序结果基本一致。为了进一步缩小miRNA的筛选范围,我们应用体外分离的小鼠和人原代棕色脂肪前体细胞并诱导分化成熟,采用β3-肾上腺素受体激动剂CL-316,243(CL)和毛喉素(FSK)模拟体外的激活状态,进一步检测差异miRNA的表达变化。研究结果显示:相对于CL,FSK刺激下miR-23b-5p,miR-133a-3p,miR-135-5p,miR-491-5p和miR-150-3p表达明显下降,miR-455-5p表达显著增加。其中,miR-23b-5p因其体内外表达差异显著、丰度较高(CT<30)且尚未在脂肪组织或脂肪细胞中有任何功能报道,进而成为候选miRNA。为进一步提示miR-23b-5p在棕色脂肪细胞中发挥重要的调控作用,我们在在体CL药物刺激和不同周龄小鼠BAT中检测miR-23b-5p的表达,并分析miR-23b-5p表达水平与BAT功能标志基因Ucp-1的表达是否存在相关性,结果显示:miR-23b-5p在CL刺激的BAT中表达显著下调,且随着小鼠年龄增加在BAT中逐渐升高;miR-23b-5p与BAT功能标志基因Ucp-1的表达成显著负相关。以上证据进一步支持我们提出的设想:miR-23b-5p可能负向调控棕色脂肪细胞分化与产热的过程。为了探究miR-23b-5p在棕色脂肪细胞中的功能,我们通过构建miR-23b-5p过表达的慢病毒载体在小鼠棕色脂肪前体细胞中过表达miR-23b-5p,对细胞的成脂分化和产热的能力进行评估。结果显示:过表达miR-23b-5p对小鼠棕色脂肪细胞成脂水平无影响,但可以显著减少线粒体的数量和损害线粒体功能,降低棕色脂肪细胞功能标志基因Ucp-1的m RNA和蛋白水平。通过Targetscan、RNA22、miRwalk等miRNA数据库对miR-23b-5p潜在靶基因进行预测,其中Fatp4、Adam12、Ern1基因成为候选靶标,其3’UTR存在与miR-23b-5p结合的位点。q PCR检测结果显示miR-23b-5p过表达后,仅有Ern1的表达水平显著降低,而其他基因无显著变化。荧光素酶报告基因检测提示miR-23b-5p与靶标ERN1的3’UTRs不存在结合关系。结合已有的文献报道,棕色脂肪细胞产热功能的调节与脂肪细胞脂解过程、线粒体呼吸链各组分、脂肪酸β氧化过程密切相关。为了寻找miR-23b-5p下游调控的线索,我们筛选了以上三个过程中重要的基因,结果显示:miR-23b-5p主要是通过调控脂解和脂肪酸β氧化途径来影响产热,而对线粒体呼吸链各组分的表达无显著影响。综上所述:寒冷相关的miRNA参与BAT功能的调节,其中miR-23b-5p在棕色脂肪细胞产热相关的基因程序调控中可能发挥重要的作用,阐明其调控因素及对棕色脂肪细胞生热功能的作用与机制,将有助于完善棕色脂肪细胞功能调控网络,为开发棕色脂肪功能激活的新药物提供支持,为肥胖治疗带来光明的前景。第一部分寒冷刺激下棕色脂肪组织中miRNA的筛选与验证目的:筛选并验证寒冷刺激下小鼠BAT中差异表达的miRNA,进一步探讨差异miRNA在小鼠及人棕色脂肪细胞体外激活状态下的表达变化。寒冷刺激BAT中差异miRNA的筛选为我们明确某个或多个miRNA在棕色脂肪细胞中的作用提供了前期的实验基础。方法:通过miRNA-seq技术对室温(RT,26±2℃)和寒冷刺激(4°C)下小鼠肩胛区的棕色脂肪组织(i BAT)进行miRNA测序。根据信号值大、组内差异小、组间差异|表达变化量|≥1,P值<0.05的原则,对初步筛选的20条miRNAs进行Realtime PCR技术验证。此外,我们应用小鼠和人原代分离并诱导分化成熟的棕色脂肪细胞,选用β3-肾上腺素受体激动剂CL316,243(CL)和下游信号通路中关键分子c AMP诱导剂毛喉素(FSK)处理体外模拟寒冷激活的β3-肾上腺素受体-c AMP信号通路,通过Realtime PCR技术对寒冷刺激后差异表达显著的miRNAs进行再次验证。结果:(1)寒冷刺激后,BAT中有82条miRNAs表达发生显著变化。20条候选miRNA进行Realtime PCR验证,结果与测序数据基本一致。寒冷刺激后差异表达显著的有11条miRNAs,其中miR-455-5p,miR-182-5p,miR-6715-5p,miR-3065-5p和miR-3073a-3p表达水平上调,而miR-150-3p,miR-135a-5p,miR-1a-3p,miR-23b-5p,miR-133a-3p和miR-491-5p表达水平降低。然而,miR-9769-3p,miR-203-5p,miR-7068-3p,miR-1a-1-5p,miR-363-3p,miR-1941-5p以及miR-133a-5p在寒冷刺激后表达差异无统计学意义。(2)CL和FSK刺激后,小鼠和人棕色细胞功能标志基因Ucp-1和Pgc1α的表达显著上调,证明体外棕色脂肪细胞激活的模型是成功的,其中FSK刺激效应更为显著。(3)通过肾上腺素能及c AMP刺激结果显示:miR-455-5p、miR-133a-3p、miR-150-3p、miR-135a-5p、miR-23b-5p和miR-491-3p表达有变化。结论:我们通过miRNA-seq技术筛选寒冷刺激后棕色脂肪组织中差异表达的miRNA,并通过体外模拟寒冷刺激β3-肾上腺素受体-c AMP信号对差异表达的miRNA再次进行验证。其中已有文献报道miRNA(miR-455、miR-133、miR-150)在棕色脂肪细胞分化和产热中发挥重要作用,进一步支持了所做的测序数据的准确性。其中miR-23b-5p,miR-491-3p、miR-455-5p,miR-133a-3p和miR-150-3p对β3-肾上腺素能信号通路或c AMP刺激较为敏感。miRNA-23b-5p的表达丰度相对较高(CT<30)、差异变化显著、且在脂肪组织或细胞中尚无任何研究报道,因而成为候选miRNAs,值得作进一步的功能研究。第二部分miR-23b-5p调控棕色脂肪细胞的功能分析目的:进一步探讨药物刺激下miR-23b-5p的表达变化,通过慢病毒载体在棕色脂肪前体细胞中过表达miR-23b-5p,去检测和评估棕色脂肪前体细胞成脂分化和产热的能力。方法:在CL药物刺激模型下检测miR-23b-5p在小鼠BAT和ing WAT中表达水平的变化,检测不同年龄小鼠的BAT中miR-23b-5p的表达水平,并分析miR-23b-5p表达水平与BAT功能标志基因Ucp-1的表达是否存在相关性。用慢病毒过表达miR-23b-5p,去感染基质血管成分(Stromal Vascular Fraction,SVF)来源的小鼠肩胛区棕色脂肪前体细胞,并以转染空载病毒的相同细胞为对照组。地塞米松、吲哚美辛,胰岛素、T3,罗格列酮和1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)方案诱导细胞分化成熟,油红O观察其成脂分化过程中脂滴形成情况;酶比色法检测成熟脂肪细胞中的甘油三酯含量;采用Realtime PCR技术检测脂肪分化相关基因(Pparγ,C/ebpβ,C/ebpα和Fabp4)的表达变化。通过对分化的棕色脂肪细胞的线粒体拷贝数检测(m Nd1和m Cox1)和线粒体荧光探针染色(Mitotraker Grenn)来评估线粒体数量。通过seahorse能量分析仪动态地监测脂肪细胞耗氧的变化。Realtime PCR对棕色脂肪特异性基因进行检测。Western Blot技术和细胞免疫荧光技术检测UCP-1的表达变化。结果:(1)使用β3受体激动剂CL刺激之后,miR-23b-5p在BAT和WAT的表达水平都明显下调。(2)miR-23b-5p的表达水平随着小鼠年龄的增长而不断增加。(3)miR-23b-5p与BAT功能标志基因Ucp-1的表达成显著负相关。(4)油红O染色和甘油三酯实验表明miR-23b-5p过表达对脂肪堆积的效果较弱,一些分化相关的基因像Pparγ,C/ebpβ,C/ebpα和Fabp4也没有发生明显的改变.(5)m Nd1和m Cox1的表达水平在miR-23b-5p过表达的棕色脂肪细胞中都是下降的,Mitotraker Grenn染色检测也显示了在miR-23b-5p过表达的棕色脂肪细胞中线粒体丰度减少.(6)miR-23b-5p过表达后棕色脂肪细胞中Ucp-1,Dio2,Cidea和Cyto C这些基因的表达水平都是下调的,细胞免疫荧光染色和Western Blot检测显示UCP-1在miR-23b-5p过表达后都明显减少。结论:miR-23b-5p的表达水平受寒冷刺激和β3受体激动剂的调控,并且miR-23b-5p在BAT中的表达水平随着小鼠年龄的增长而不断增加。miR-23b-5p与BAT功能标志基因Ucp-1的表达成显著负相关。miR-23b-5p过表达对脂肪堆积的效果较弱,但慢病毒介导的miR-23b-5p过表达能减少线粒体的含量,抑制耗氧能力,并减少棕色脂肪细胞特异性基因表达水平。第三部分miR-23b-5p调控棕色脂肪细胞的机制研究目的:探讨miR-23b-5p调控棕色脂肪细胞可能机制。方法:通过Targetscan、RNA22、miRwalk等miRNA靶基因预测网站对miR-23b-5p的靶基因进行分析并挑选出潜在的靶基因进行验证。通过Realtime PCR技术和荧光素酶报告基因检测对潜在的靶基因(Fatp4,Adam12、Ern1)进行验证。采用Realtime PCR技术和Western Blot技术对参与呼吸链/氧化磷酸化、脂肪分解代谢和脂肪酸β氧化过程来发挥产热功能的相关基因进行检测。结果:(1)对这些潜在的靶基因进行Realtime PCR技术定量验证,结果表明Ern1显著下降,Fatp4,Adam12表达水平变化不显著,并且Ern1的表达水平经过CL和FSK刺激之后显著升高,然而,荧光素酶报告基因检测提示miR-23b-5p与靶标ERN1的3’UTRs不存在结合关系。(2)Realtime PCR定量结果表明在棕色脂肪细胞miR-23b-5p过表达可以显著降低参与AMP激活的蛋白激酶Ampkα1,Ampkα2,Ampkβ2,激素敏感脂肪酶Hsl,以及磷脂酶域的Atgl和Glut4的表达水平。(3)棕色脂肪组织中含有的特征性线粒体脂肪酸β氧化相关酶包括酰基辅酶A(acyl-Co A),合成酶短链家族成员1(Acss1),酰基辅酶A合成酶-1(Acsl1),酰基辅酶A合成酶-5(Acs15),中链酰基-Co A脱氢酶(Acadm),短链酰基-Co A脱氢酶(Acads),长链酰基-Co A脱氢酶(Acadl)和3-氧酰酰-Co A硫解酶(Acaa2)都表现出显著的降低。(4)与呼吸链/氧化磷酸化密切相关的基因在NC和miR-23b-5p过表达组中表达水平基本相同。(5)Western blot检测进一步显示Ampkα,Hsl,Atgl,Glut4,Acsl1,Acadm,Acss1和Acads参与脂肪分解和脂肪酸β-氧化途径的基因在miR-23b-5p转染的细胞中蛋白表达水平也显著减少。结论:miR-23b-5p可能是通过脂肪分解代谢和脂肪酸β-氧化途径来抑制细胞的生热作用。