论文部分内容阅读
背景与目的:肺癌是全球致死率最高的肿瘤类型,其治疗方法的革新一直备受关注。顺铂是肺癌的一线化疗药物,但敏感性降低的问题限制了临床应用。敏感性降低可能与肺癌实体肿瘤发展过程中内部形成的缺氧微环境相关。缺氧是由于肿瘤细胞增殖速度快于血管新生或异常新生血管引起的。缺氧改变实体肿瘤微环境,并与肿瘤增殖、转移和药物敏感性有关。缺氧可促进上皮间质转化（EMT）和癌细胞的干细胞化,这有利于癌细胞生存。EMT被认为是肿瘤进展恶化的驱动力,也被认为是晚期肿瘤的重要特点。在EMT过程中,间质标志物N-cadherin和Vimentin上调;同时,转录因子Snail激活,上皮标志物E-cadherin表达下调。随着EMT的发生产生了一群具有多向分化潜能的肿瘤干细胞,这些肿瘤细胞又进一步促使了肿瘤的转移。干性标记分子包括转录因子SOX2、NANOG、OCT4和表面标志物CD44。缺氧引起癌细胞的这些转变是由NF-κB信号通路激活介导的。缺氧导致顺铂敏感性降低的问题尚未研究清楚,联合用药有望解决这一问题。人参皂苷Rg3是从传统中药人参中提取的具有抗肿瘤作用的活性成分。在本研究中,我们评估了顺铂敏感性降低是否与缺氧有关,以及Rg3能否通过阻断缺氧改善顺铂敏感性。方法:1.利用Co Cl2来诱导缺氧,Western blot实验检测HIF-1α蛋白表达进行验证。2.通过CCK-8法和克隆形成实验比较顺铂在常氧和缺氧条件下的抗增殖作用,以及检测缺氧条件下Rg3联合顺铂的抗增殖作用。3.通过DAPI染色分析、AV-PI凋亡检测法、Western blot实验检测凋亡相关分子的表达比较顺铂在常氧和缺氧条件下的促凋亡作用,以及检测缺氧条件下Rg3联合顺铂的促凋亡作用。4.通过细胞形态观察、Western blot和免疫荧光实验检测EMT相关蛋白表达比较常氧和缺氧条件下EMT的发生情况,以及检测Rg3联合顺铂的抑制作用。5.通过球体形成实验、Western blot和免疫荧光实验检测干性相关蛋白表达比较常氧和缺氧条件下干性的发生情况,以及检测Rg3联合顺铂的抑制作用。6.通过EMSA、Western blot实验检测细胞核和总蛋白NF-κB信号通路相关蛋白比较常氧和缺氧条件下NF-κB信号通路的激活情况,以及检测Rg3联合顺铂的抑制作用。Bay11-7082是NF-κB信号通路抑制剂,通过Western blot实验检测EMT和干性相关蛋白观察NF-κB信号通路与EMT和干性发生的关系。7.通过裸鼠成瘤实验检测Rg3联合顺铂的体内疗效,Western blot、免疫组化实验检测瘤组织EMT、凋亡和干性相关蛋白表达情况,验证体外实验结果。结果:1.200μM CoCl2诱导人非小细胞肺癌细胞形成体外缺氧微环境Western blot实验结果表明200μM Co Cl2处理可使非小细胞肺癌细胞HIF-1α蛋白水平在48小时内保持高表达。2.缺氧条件下顺铂对人非小细胞肺癌细胞的抗增殖和促凋亡作用减弱相同浓度顺铂作用肺癌细胞,缺氧细胞存活率和克隆形成率高于常氧,核染色质凝集程度和凋亡率低于常氧,促凋亡蛋白（Caspase-3、-8、-9、Bax）和细胞凋亡标记蛋白（PARP）的表达均低于常氧,抗凋亡蛋白（Bcl-2、survivin）的表达均高于常氧。3.缺氧诱导人非小细胞肺癌细胞EMT和干性缺氧细胞呈间质化改变,HIF-1a、Snail、N-cadherin和Vimentin表达上调,而E-cadherin表达下调。缺氧细胞球体形成率比常氧条件下高,干性相关蛋白SOX2、NANOG、OCT4和CD44表达上调。4.缺氧激活NF-κB信号通路的激活并介导EMT和干性的发生缺氧条件下诱导的NF-κB DNA结合比常氧条件下更强。缺氧激活核蛋白提取物p-p65和p65以及细胞总蛋白提取物p-p65、p65、p-IKK和IKK表达。缺氧细胞NF-κB通路抑制后,EMT相关分子Snail、N-cadherin和Vimentin下调,E-cadherin上调,干性相关分子SOX2、NANOG、OCT4和CD44下调。5.Rg3联合顺铂抑制缺氧激活的NF-κB信号通路Rg3治疗缺氧非小细胞肺癌细胞减少p-p65和p65表达,并呈浓度和时间依赖性。缺氧条件下,Rg3联合顺铂治疗组NF-κB DNA结合低于两药单独使用组,核蛋白提取物p-p65、p65以及总蛋白提取物p-p65、p65、p-IKK、IKK的表达水平最低。6.Rg3在体外增加缺氧人非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性Rg3联合顺铂治疗降低缺氧细胞活力和克隆形成率,增加核染色质凝集和总凋亡率,Caspase-3、-8、-9、Bax和PARP高表达,Bcl-2和survivin低表达。7.Rg3联合顺铂抑制缺氧诱导的EMT和干性Rg3联合顺铂明显逆转了缺氧细胞的间质化改变,Snail、N-cadherin和Vimentin低表达,E-cadherin高表达,低球体形成率以及干细胞相关蛋白SOX2、NANOG、OCT4和CD44低表达。8.Rg3增加人非小细胞肺癌细胞荷瘤裸鼠对顺铂的敏感性Rg3联合顺铂明显减少瘤组织体积及重量。Rg3联合顺铂治疗降低了瘤组织HIF-1a、p-p65、p65、N-cadherin、SOX2、OCT4、Bcl-2和Survivin的表达,增加了E-cadherin、cleaved-caspase3和Bax的表达。结论:1.缺氧降低了肺癌细胞对顺铂的敏感性。2.缺氧激活了NF-κB信号通路,并介导了EMT和干性的发生。3.Rg3抑制NF-κB信号通路的激活,并呈浓度时间依赖性。4.Rg3联合顺铂在体内外抑制缺氧激活的NF-κB信号通路及其介导的EMT和干性。5.Rg3在体内外增加顺铂药物敏感性。