激发素(elicitin)是一类由卵菌纲(Oomycete)的疫霉属(Phytophthora)和腐霉属(Pythium)真菌分泌的蛋白类激发子，在烟草与疫霉菌的互作中起无毒因子作用。隐地蛋白(Cryptogein)由隐地疫霉(P. cryptogea)所分泌，该激发素在极低浓度下能诱导烟草产生过敏性反应(HR)，并使植株获得广谱抗病性(SAR)。可以预见，将Cryptogein基因转入烟草植株中表达应能诱导产生完整的抗病防卫反应，提高对多种病原物的抗性。因此本研究以隐地疫霉为基因源，克隆了Cryptogein(Crypt)基因并经PCR定点突变获得了13位氨基酸突变的CryK13V基因，构建了这两种基因的植物双元表达载体，并转化了烟草。对两种转基因烟草的抗病性、耐盐性、农艺性状、抗病耐盐分子机理及T1代的遗传特性等进行了初步的研究。具体结果如下： 1 目的基因的克隆和改造：根据已知的核苷酸序列，设计一对引物，以隐地疫霉的基因组DNA为模板用pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，获得了一长度约为300bp的PCR产物，用酶切鉴定和测序分析证明克隆的Crypt基因与已报导的序列相同。进一步用一对突变引物进行PCR定点突变扩增，获13位赖氨酸(K)突变成缬氨酸(V)的PCR产物(OryK13V)，与pUC-mT载体连接后(pUC-CryK13V)通过酶切鉴定和测序证实与预期结果相一致。 2 构建了两个植物双元表达载体：针对Crypt基因的生物学活性和大多数病原菌从根、茎、叶等的表皮细胞侵入的特点，选用弱组成兼病菌诱导型，并能在表皮细胞中特异性表达的水稻苯丙氨酸解氨酶基因PAL启动子控制Crypt基因的表达；对突变基因CryK13V则选用35S强启动子控制。由于Crypt蛋白作用的受体位于植物细胞膜上，因此，在Crypt和CryK13V基因前设计了分泌结构(PR1b信号肽序列)；选用具有卡那霉素抗性植物双元表达载体CHF3，构建了两个植物双元表达载体CHF3-PAL-PRs-Crypt和CHF3-35S-PRs-CryK13V。用冻融法将含Crypt和CryK13V基因植物双元表达载体分别转入根癌农杆菌EHA105菌株中，通过PCR鉴定阳性的转化子用于烟草的转化。 3 转基因烟草植株的获得：将含Crypt和CryK13V基因的农杆菌与烟草叶盘共培养。经卡那霉素抗性筛选分别获转Crypt和CryK13V基因的再生植株22株和33株，PCR检测有21株和30株为阳性；部分植株的Southern杂交结果表明Crypt和 C仙JV基因己以低拷贝门～3个）整合到烟草基因组中。N0rthem杂交分析和 RTPCR检测结果表明 Cypt和 C他三厂基因在转化烟草植株中有低水平的表达。 4 TO、TI代转基因烟草植株的抗病性分析：用不同接种方法测定转基因烟草植株的抗病性，统计分析结果表明，约一半（54．9％）的植株同时对烟草上3种重要病原菌高抗，80％左右的转基因植株对 3种病原菌的抗性比对照增强。引株转基因烟草植株中对烟草黑脏病菌高抗（0级）的有35株，抗病门～二级）的有8株，感病（3级）的有8株。对烟草赤星病菌高抗（0级）的有33株，抗病门～2级）的有9株，感病（3级）的有9株。大部分转基因烟草植株（81．8％）对烟草野火病均表现为高抗（0级）。而未转基因的烟草植株对3种病原菌均表现为感病。表明大部分转Cyp t和Cp 3厂基因烟草植株具有广谱抗病性。转Cyp t和CyK 3厂基因烟草植株对烟草上3种病原菌的抗性反应基本相近。 5 转基因烟草的耐盐性测定：将转基因和非转基因烟草种子播于含200 mMNaCI的1o 培养基上测定耐盐性。结果表明：大部分转基因烟草小苗的耐盐性比对照强，在含 200 mM NaCI的 1o 培养基中生长 40 d左右，转基因烟草小苗生长和生根基本正常；而转未转基因的烟草种于萌发后生长和生根明显被抑制，最后死亡。表明转基因烟草的耐盐性显著增强。 6 转基因烟草植株抗病、耐盐增强的分子机理初探：用Northern杂交对抗病。耐盐分子机理进行了初步探讨。结果表明：具有高水平 PR－la蛋白积累的转基因植株具有更强和更广的抗病性；PR－la等防卫反相关基因快速和超量诱导表达可能是转基因植株抵抗病原菌侵入的另一种机制。转录因子OPBI的活化与转基因烟草植株的耐盐、抗病性有一定的正相关性；渗调蛋白PRJ基因高水平组成型或诱导型表达也是提高转基因烟草植株耐盐性的原因之一。 n Cptogin基因对烟草其它农艺性状的影响：大部分转基因植株生长正常，并在长势、植株高度、生育期等有一定程度的改变，表现为苗期促进发棵，生长期长势旺盛、植株高度增加，生育期缩短，开花提早。也有少数转基因植株表现为矮化，不能正常现蕾、开花、结籽等异常现象。 8 TI代转基因烟草遗传分析：以卡那霉素抗性为筛选标记结合PCR检测，对部分＊代转基因烟草进行分离比测定，同时结合Southern杂交估算整合的拷贝数。结果转基因烟草TI代的分离基本符合孟德尔 3：1、15：1和 64：1的遗传规律。大多数转基因植株以单拷贝整合，少数为2个或3个拷贝整合。TO代抗病的转基因植株 TI代普遍表现为抗病，表明整合的 Cypt和 CIyK二厂基因己稳定遗传和表达。