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以尿道褶不完全融合致尿道沿腹侧异常开口为特征,尿道下裂(Hypospadias)是男孩最为常见的泌尿生殖器畸形之一。估计亚洲、欧洲和北美的新生男婴患病率介于0.3%到0.8%,其发病率在全世界范围内呈上升趋势。尿道下裂是一种复杂的疾病,大部分病例尤其是轻症患者病因不明。环境和内分泌因素参与致病过程,更多调查表明其强烈的遗传背景。部分患者有明显的家族聚集性,多种涉及雄激素信号通路的酶参与尿道发育,编码、调控这些酶的相应基因的功能学变化影响病情发展,到目前为止,如5α-还原酶(5a-reductases, SRD5A2)、雄激素受体(AR)、LH-受体、ATF3和FGF8／10等多种基因被发现为尿道下裂候选基因。在胚胎睾丸分泌的雄激素影响下,正常的男性外生殖器发育介于第8至第16孕周,生殖结节自近端延长而成阴茎干和阴茎头。由于尿道下裂是胚胎性分化过程中发育停滞造成的,因此可被视为连续过程,融合过程越早被打断,其表现型越严重或复杂。男性外生殖器形成需要一种特异雄激素：睾酮(testosterone, T)。胎盘人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, hCG)刺激胚胎睾丸内Leydig细胞产生睾酮,在Leydig细胞内,17p-羟基固醇脱氢酶(17beta-hydroxysteroid dehydrogenase 3, HSD17B3)催化雄烯二酮(androsternedione)生成睾酮,睾酮可被类固醇激素5α-还原酶转化成活性更强的双氢睾酮(dihydrotestosterone, DHT),两种酶均可结合至生殖靶组织内的雄激素受体。睾酮诱导吴非氏管(Wolffian duct)或称中肾管(mesonephric duct)发育成附睾等,结合至同一受体的双氢睾酮调节阴茎和阴囊等的分化。因此,任何有可能影响生殖结节延长或尿生殖褶融合的因素,都有可能造成尿道下裂；任何影响雄激素通路及其受体、5α-还原酶的关键基因突变,造成胚胎性别分化过程发育停滞,都有可能是尿道下裂的易感基因。X染色体Xq28位点缺失最初发现于肌管性肌病病人：生殖发育在肌管素1(myotubularin, MTM1)基因内突变的患者正常,而在MTM1基因位点缺失的患者则出现了不同程度的异常。后续试验表明,所有出现46,XY性发育异常(Disorder of sexual development, DSD)的肌管性肌病患者,除了Mastermind-like domain containing 1 (MAMLD1)基因,在共同缺失区域未发现其他候选基因。这些发现表明MAMLD1是46,XYDSD极佳的候选基因,特别是尿道下裂。进一步的实验表明MAMLD1基因在性发育的关键时段表达于胚胎Sertoli和Leydig细胞,小鼠Leydig肿瘤细胞一过性敲除MAMLD1 mRNA表达会导致睾酮表达显著降低。MAMLD1和性发育中调节转录的类固醇生成因子(steroidogenic factor-1, SF-1)共同表达,并在MAMLD1基因发现了SF-1结合位点。据此可认为MAMLD1在性发育过程中调节睾酮产生。相关研究已经证实在尿道下裂病例中发现了多个导致MAMLD1功能减弱的点突变。在性腺分化为睾丸后,SF-1持续表达于睾丸早期体细胞,在和Y染色体性别决定区(sex determining region Y, SRY)共同维持SOX9表达方面可能起重要作用。在支持细胞,大约从第7孕周开始,SF-1激活苗勒管抑制物(mullerian-inhibiting substance, MIS;也称抗中肾旁管激素,anti-Mullerian hormone (AMH))的表达,诱导发展中的男性Mullerian结构退化。在Leydig细胞,从第8孕周开始,SF-1激活类固醇生成酶系统使外生殖器男性化。通过下丘脑-垂体-类固醇轴,SF-1转录调控一系列参与肾上腺和性腺发展的基因、性别分化、类固醇合成以及生殖过程,因此在关键时段SF-1相对小的活性改变也可引起内分泌系统和临床的“级联反应”。然而到目前为止,对如何调节SF-1知之甚少,尽管诸如WT1等因子启动子和增强子,影响SF-1表达的许多重要机制仍需进一步阐明。在此领域的进一步研究对明确SF-1明确在人类疾病中的作用有重要意义。本论文目的是研究尿道下裂候选基因及其作用机制,由两部分组成：第一部分通过对散发性尿道下裂患者MAMLD1基因直接测序等相关研究和功能预测；第二部分通过测序和基因分型研究SF-1基因在尿道下裂中的作用,尤其是p.G146A (rs1110061)和尿道下裂的关系。第一部分MAMLD1基因在尿道下裂中作用机制研究目的：在研究性染色体异常在尿道下裂中的发病率以后,在大样本散发性病例中对MAMLD1基因扫描以进一步阐明其突变谱及其在尿道下裂中的作用机制。材料：本实验选择从瑞典收集的500个进行手术的、不同严重程度的的尿道下裂患者样本,从卡罗林斯卡大学附属医院收集的760个健康志愿者作为对照。(1)从外周血或手术获得的阴茎皮肤组织中提取DNA；(2)利用Primer3软件针对外显子设计引物,利用PCR扩增出相应片段；(3)纯化PCR产物,用BigDye(?) Terminator v3.1试剂盒分别利用正向和反向引物对相应片段进行测序,然后在ABI3730测序仪上进行扫描,结果用Seqscape2.5软件进行分析；(4)基因分型和统计分析：选择rs41313406,rs61740566,rs2073043进行基因分型：(5)在线软件NetGene 2.0 NNSplice and HSF 2.4进行剪切位点预测；ClustalW2分析同源氨基酸序列；Phyre检测基因突变对蛋白质三级结构和功能的影响。结果：(1)非整倍性X染色体筛选从样本中去除非整倍性X染色体或嵌合子(2)对99个散发性尿道下裂患者和95个男性健康对照进行直接测序。实验组中分别发现1个p.V432A,p.Q529K(,c.2065+8a>t和p.D686D,且均未在对照组95个健康人中发现；p.P286S和p.N589S实验组中分别发现11例,对照组未发现；实验组中CAG10>CAG13在3个病例中发现,同时在对照组发现1例。非同义突变p.Q529K、同义突变p.D686D和非编码区突变c.2065+8a>t为新的发现。(3)在370例患者和418名男性对照中,p.P589S显示统计学意义(p<0.05),而p.P286S和p.V432A无统计学意义。单元型[p.286S,p.589S]在实验组中轻度增加,和对照组相比p值位于临界值0.05附近。(4)同源性分析显示p.P286S和p.Q529K分别位于脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)重复区域；p.53lins3Q位于和p.Q529K谷氨酰胺(Q)同一区域,预测显示可改变蛋白质结构。结论：我们的发现表明小部分尿道下裂可能由MAMLD1基因突变引起,单元型[p.286S,p.589S]可能是尿道下裂的一个危险因素。第二部分类固醇生成因子-1(SF-1)基因在尿道下裂中作用机制研究目的：类固醇生成因子-1(SF-1,NR5A1,Ad4BP)下丘脑-垂体-类固醇轴中起重要作用,在46 XY性发育异常(46 XY DSD) SF-1基因中发现了越来越多的突变,我们试图研究其和散发性尿道下裂的关系。材料和方法：选择95个不同严重程度的的散发性尿道下裂患者样本,对其编码外显子和侧翼区域直接测序。对单核苷酸多态性rs1110061：G>C进行基因分型：380例尿道下裂患者作为实验组,766个健康志愿者作为对照。结果：通过直接测序,95例患者中发现2个单核苷酸多态性,p.P125P(rs1110062)和p.G146A(rs1110061)：其中3例为[p.P125P,p.G146A]型,均为严重尿道下裂；2例为纯合子p.G146A,3例为杂合子p.G146A。选择单核苷酸多态性rs1110061作基因分型：实验组中368名患者发现30例G／C基因型(21例杂合子)或C／C基因(9例纯杂合子),为8.15%；对照组中,760病例发现21例杂合子(2.76%),未见纯合子。显示出明显统计学意义((p<0.0001)。结论：SF-1 rs1110061：G>C在尿道下裂患者中增加明显,[p.P125P,p.G146A]基因型和散发性尿道下裂的关系尚需进一步实验论证。SF-1应被认为是尿道下裂的易感基因。