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猫杯状病毒(Feline caliciviras,FCV),属于杯状病毒科水疾疹病毒属的成员,基因组为单股、正链RNA分子,病毒颗粒无囊膜,核衣壳呈20面体对称。FCV是猫群中广泛分布的一种具有高度传染性的病原,能够引起猫的口腔和上呼吸道疾病,称之为猫传染性鼻结膜炎(infectious feline rhinitis-conjunctivitis)。临床症状包括:鼻炎、结膜炎和口腔溃疡,严重时出现支气管炎和肺炎,目前接种疫苗是预防该病的主要措施。该病诊断主要依靠病毒分离和RT-PCR,而感染猫及免疫猫体内抗FCV抗体水平的监测方法主要包括中和试验和间接ELISA方法,中和试验是用于检测抗FCV抗体的主要方法,但这种方法费时费力;间接ELISA用于检测抗FCV抗体,快速且灵敏,然而对包被抗原的纯度有一定的要求。因此,本研究首先对F81细胞培养的FCV进行纯化,然后以纯化的FCV作为包被抗原,成功地建立了一种快速检测抗FCV抗体的方法。本研究首先通过饱和硫酸铵沉淀法和蔗糖密度梯度离心法对F81细胞培养的FCV进行纯化,然后对纯化的病毒,经磷钨酸盐负染电镜观察、蛋白浓度测定、TCID50测定、SDS-PAGE和Western Blot鉴定。结果显示:在电镜下可观察到呈球形的杯状病毒粒子;纯化FCV的蛋白浓度为2.35 mg/mL:TCID50较纯化前上升了一个滴度,为10-8.5;经SDS-PAGE鉴定纯化的FCV在60 kDa处有单一条带:经Western Blot鉴定纯化的FCV与猫抗FCVP阳性血清发生特异性反应。以纯化的FCV为包被抗原、辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗猫IgG为二抗,建立检测抗FCV抗体的间接ELISA方法。首先通过双方阵法确定了纯化的FCV的最佳包被浓度和猫抗FCV阳性血清的最佳稀释倍数;其次对包被时间、血清作用时间、封闭剂的选择、封闭时间、酶标二抗稀释倍数和底物作用时间进行了优化。建立的间接ELISA方法的最佳反应条件为:纯化FCV的最佳包被浓度为4 μg/mL;猫抗FCV阳性血清的最佳稀释倍数是1:80,37℃作用1 h:最佳包被时间为4℃包被过夜;最佳封闭液为5%牛血清白蛋白,最佳封闭时间为37℃ 2 h;二抗的最佳稀释倍数为1:2000,37℃作用1 h;OPD底物最佳作用时间为10 min,2 mol/L H2SO4终止显色,在492 nm处测定吸光值,并确立了阴阳性临界值为0.318。此外,建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好:且与中和试验的符合率达到90%。本研究纯化的FCV为后续单克隆抗体的制备奠定了物质基础,同时以纯化的FCV包被抗原成功地建立了检测抗FCV抗体的间接ELISA方法,为FCV的诊断和流行病学调查提供了有效的方法。