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拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海地区主要的海产蟹类之一,隶属于甲壳纲,青蟹属。本研究基于拟穴青蟹的转录组数据,拟从分子生物学的角度,对拟穴青蟹生长发育和盐度胁迫过程中与调控相关的Na~+/H~+-exchanger,Na?/K?-ATPase和ANT2进行克隆和表达模式分析,获得的主要研究结果如下:1.拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger的克隆和表达分析Na~+/H~+-exchanger基因在海水蟹类盐度胁迫过程中起重要作用,本研究克隆了拟穴青蟹(Scylla paramamosain)Na~+/H~+-exchanger基因,其cDNA序列全长3624 bp,开放阅读框(ORF)长2886 bp,可编码961个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别为110.8 kD和7.42,有典型的Na~+/H~+-exchanger蛋白结构域,且含12个跨膜α螺旋。拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger的氨基酸序列与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的一致度最高,达到84.9%;Na~+/H~+-exchanger基因在卵巢中表达水平最高,其次是精巢、鳃等组织;该基因在受精卵时期表达水平最高,大眼幼体时期次之。拟穴青蟹大眼幼体在低盐(盐度7和17)胁迫过程中,Na~+/H~+-exchanger基因在20 min表达量显著上调,之后基本恢复到正常表达水平;在高盐(盐度37)胁迫(20 min—2 h)期间,该基因表达水平先下降再逐渐上升。结果表明Na~+/H~+-exchanger基因在拟穴青蟹大眼幼体阶段盐度适应中可能发挥着重要作用,低盐胁迫可诱导Na~+/H~+-exchanger基因的高水平表达,推测拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger基因在低盐环境下能够起到重要的渗透压调控作用。本研究首次完整克隆了拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger的cDNA全长,并进行了生物信息学分析,利用实时定量PCR技术(RT-qPCR)探究了该基因在不同组织、不同幼体时期和不同盐度处理组的表达水平变化。同时,针对更容易遭受盐度改变影响和直接影响海水蟹蜕壳变态和培育成活率的大眼幼体时期,研究了拟穴青蟹大眼幼体时期盐度胁迫下Na~+/H~+-exchanger的表达情况。通过对广盐性甲壳动物Na~+/H~+-exchanger基因的渗透调节机理的研究,对拟穴青蟹耐低盐新品系的选育和拟穴青蟹育苗成功率的提高都有参考意义。2.拟穴青蟹Na?/K?-ATPase的克隆及表达分析甲壳类动物渗透调节的器官包括鳃、内脏和触角腺(或排泄器官)。其中鳃具有多种功能,包括气体、离子交换、渗透压调控和酸碱平衡等。拟穴青蟹属广盐性海蟹,具有主动调节其血液淋巴渗透压的能力。其中氮、钾三磷酸酶是离子传输的主要驱动力,Na?/K?-ATPase的酶活性反映了甲壳类动物的渗透压调控能力。目前尚没有对拟穴青蟹不同组织和不同时期的Na?/K?-ATPase表达进行详细研究,我们对Na?/K?-ATPase基因进行了生物信息学分析,利用RT-qPCR分析表明拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger基因的表达具有组织特异性,该基因在鳃中表达量最高,这印证了腮组织可能是海水蟹重要的渗透压感受和调控器官。盐度胁迫结果表明,拟穴青蟹Na?/K?-ATPase基因可能是低盐调控中维持机体稳态重要的调控基因。3.拟穴青蟹ANT2的克隆及表达分析腺苷酸转移酶(adenine nucleotide translocase,ANT),即ADP/ATP转运蛋白(ADP/ATP Carrier,AAC)通过构象变化来保证细胞质中ADP和线粒体内ATP间的跨膜交换,在细胞凋亡诱导过程中和与线粒体疾病相关的细胞增殖中、调节生物机体的耐寒和耐低盐生理过程可能都起着重要作用。虽然拟穴青蟹是广温性、广盐性蟹类,但不同季节盐度等环境条件的变化会影响其繁殖、分布和迁移,而且甚至能够直接导致其体内的生理和生化变化。有研究表明ANT2基因对拟穴青蟹的盐度适应有一定作用和影响,为进一步阐明拟穴青蟹环境适应尤其是盐度环境改变胁迫下调控适应的分子机制,ANT2基因的生物信息学分析和转录表达水平结果表明,拟穴青蟹ANT2在心脏中表达量最高,而在鳃、眼柄等组织表达量很低或几乎没有,ANT2不在这些渗透压调控器官高表达,其可能不是直接的低盐胁迫调控蛋白。高盐胁迫中,ANT2基因基本与对照组基本一致,在2h和6h表达水平略微上升,推测在高盐胁迫中该基因不是一个快速应答的基因。综上所述,本研究克隆获得三种与盐度胁迫相关的三种基因Na~+/H~+-exchanger,Na?/K?-ATPase和ANT2,并做了相应的生物信息学分析,同时对它们在拟穴青蟹中的表达模式进行了研究。对更易遭受盐度改变影响的海水蟹蜕壳变态和培育成活率的大眼幼体时期,研究了拟穴青蟹大眼幼体盐度胁迫下重要调控基因的表达模式,探索了拟穴青蟹低盐适应的分子机制。研究结果表明,Na~+/H~+-exchanger,Na?/K?-ATPase和ANT2可能参与了拟穴青蟹的幼体生长发育,这些基础研究对进一步揭示甲壳动物的渗透压调控机制提供了数据支持。