第一部分大鼠uPA基因调控区域的构建及活性分析实验一大鼠睾丸组织uPA基因启动子区的克隆与分析目的：克隆大鼠睾丸组织uPA基因的启动子区并对该序列进行分析。方法：从大鼠睾丸组织中提取基因组DNA，以其为模板设计uPA基因的引物，运用降落PCR法扩增uPA基因5’端上游的真核转录调控序列。将得到的PCR产物克隆测序，测序结果用启动子区的分析软件进行分析，并与其DNA序列进行比对。结果：得到的uPA基因长度为1517 bp（ID：25916），经软件分析：该序列包含uPA基因完整的开放阅读框（ORF）、21bp长的外显子部分，1496bp长区域为转录起始的上游部分即是真核转录的调控区域。在其5’端UTR区的-30 bp的位置有一个不典型的TATA盒，其上游有非常明显的GC盒及启动子区常见的AP-1（Active protein 1）、SP1等结合位点。结论：本文已成功克隆大鼠睾丸组织uPA基因启动子区。分析表明，该片段包含真核转录调控区域、一个不太明显的TATA盒、非常典型的GC盒及启动子区所常见的AP1、SP1等结合区域。实验二大鼠睾丸组织uPA基因核心启动子的验证目的：分析uPA基因启动子的结构和活性，明确调控uPA基因转录的启动子片段，探讨uPA的表达调控机制，研究uPA基因5’非编码区（NCR）在支持细胞内对uPA翻译启动功能的作用。方法：从大鼠的基因组DNA中分离到约1．6 kb 5’旁侧区（flanking region）片段的大鼠uPA蛋白基因组基因序列，进而分析大鼠uPA 5’旁侧区片段中包含的启动子长度、结构、转录起始位点调节因子框架，以此设计5对引物，以大鼠基因组DNA为模板，梯度PCR分段扩增获取大鼠uPA基因5’旁侧区不同长度片段，经纯化、测序鉴定。将大鼠uPA5’旁侧区不同长度片段分别插入到没有启动子的PGL₃-Enhancer质粒中荧光素酶报告基因上游，构建质粒经菌落PCR、双酶切鉴定。将重组载体转染支持细胞（Sertoli cell）细胞24h后，Lumat弱光仪检测细胞裂解产物中荧火虫荧光素酶的表达活性以比较各片段的启动活性，确定uPA基因5’旁侧区的核心启动活性区。结果：P1-167／+40（21 1bp）、P2-455／+40（499bp）、P3-758／+40（802bp）、P4-1 156／+40（1220bp）、P5-1544／+40（1588bp）这5个启动子片段具有转录活性，而-455／+40启动子片段的转录活性最强，-167／+40、-1546／+40转录活性其次，-758／+40、-1156／+40这2个启动子片段转录活性很弱。结论：近uPA基因转录起始点上游1600 bp的序列为大鼠uPA基因启动激活所必需，其中-465／+40序列区为uPA基因启动子的核心部分。-167／-455、-1156／-1544之间存在调控性启动子或增强子等其它一些顺式元件，-455／-758、-758／-1156之间存在转录负性调控因子。获得了含核心启动子活性序列-455／+40的荧光素酶报告基因重组载体，有望以此序列发现与专一调控uPA基因转录相关的特异DNA结合蛋白。为进一步阐明uPA基因转录调控机制、探讨uPA对生精过程调节奠定基础。第二部分LPS在大鼠支持细胞中对uPA基因转录核心活性区域的作用实验一LPS对uPA基因转录活性区域的影响目的：观察LPS对uPA基因转录调控区域的诱导作用，探讨uPA转录的具体调控机制。方法：以PGL₃-Control载体为对照，与验证明确的重组载体PGL3-uPA-499bp分别转染到支持细胞后，LPS分别进行诱导，诱导时间分别为0、12、24、48h。诱导后用双荧光素酶系统进行比较，Lumat弱光仪检测诱导前后荧光素酶活性变化，同时观察二组间荧光素酶活性差别。结果：PGL₃-Control载体对照组在LPS诱导下0、12、24、48h荧光素酶活性差别不大，重组载体PGL3-uPA-499bp在LPS诱导下0、12、24、48h荧光素酶活性有差别，以24h作用显著。PGL₃-Control载体对照组与重组载体PGL3-uPA-499bp比较其荧光素酶活性变化较大。结论：双荧光素酶检测结果表明LPS对uPA基因核心转录调控区域有上调作用，能够调节启动活性。PGL₃-Control的CMV启动子在LPS刺激后没有明显差异，uPA基因核心转录区域在刺激后有明显差异，但是LPS对uPA基因核心转录调控区域的上调作用并不随着刺激时间的增加而增加，有转录活性增加的强度观察在一定量LPS刺激下12h活性最强。在一定量LPS刺激下没有时间依耐性，由此说明uPA基因转录活性的增加不具有时间依耐性。实验二LPS刺激大鼠支持细胞uPA的变化目的：LPS对uPA基因转录调控区域有上调作用，进一步观察LPS刺激下uPA在支持细胞的表达。方法：免疫细胞化学（IHC）方法观察LPS刺激支持细胞0、12、24、48h后与空白对照组比较uPA蛋白的分泌情况，统计学方法分析uPA蛋白表达强弱。结果：免疫细胞化学结果表明LPS刺激下uPA在支持细胞胞浆分泌增加，以刺激12h较显著。结论：这一结果与前期研究LPS刺激uPA基因转录调控区域上调具有一致性。由此可以说明LPS刺激uPA分泌增加是通过基因转录水平调控机制发挥作用，转录活性上调导致表达水平增加。第三部分大鼠uPA基因I FN刺激应答机制在生殖系统的研究实验一LPS刺激信号转导途径中细胞因子IL-1、IL-6的变化目的：LPS刺激支持细胞胞浆uPA分泌量增加，但是相关性细胞因子IL-1、IL-6转录水平的变化情况还不清楚，目前已有研究表明LPS刺激下细胞上清液中IL-1、IL-6分泌量会有增加，不具有LPS剂量及时间依从性，但是目前的研究只局限在LPS变化下支持细胞分泌IL-1、IL-6的变化。进一步研究LPS-TLR4信号转导通路IL-1、IL-6所发挥的作用及信号通路中细胞因子的相关性。方法：用LPS与anti-IRF3干扰支持细胞0、12、24、48h用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）方法检测IL-1、IL-6转录水平mRNA变化情况，以单因素LPS及anti-IRF3做对比检测分析IL-1、IL-6转录水平mRNA变化情况后统计学分析检测结果。结果：（1） LPS刺激组IL-1、IL-6 mRNA表达量较LPS+anti-IRF3组IL-1、IL-6 mRNA表达量多，差异具有统计学意义（P＜0．05）。（2）anti-IRF3组与空白对照组比较发现IL-1、IL-6的mRNA表达水平没有差异，此两组分别与LPS组比较其IL-1、IL-6的mRNA表达水平明显减少，差异具有统计学意义（P＜0．01）。（3） anti-IRF3组、空白对照组与LPS+anti-IRF3组比较其IL-1、IL-6的mRNA表达水平减少，差异具有统计学意义（P＜0．05）。（4）各组在0、12、24、48h检测IL-1、IL-6mRNA水平没有LPS刺激时间依耐性。结论：IL-1、IL-6是LPS诱导MyD88非依赖途径信号转导通路中的关键细胞因子。在LPS刺激下用anti-IRF3拮抗IRF3作用，IL-1、IL-6mRNA表达水平降低，表明anti-IRF3拮抗IRF3后支持细胞对LPS具有明显的抗性。在没有LPS刺激下只用一种因素anti-IRF3拮抗IRF3结果表明IL-1、IL-6mRNA表达水平没有变化，说明必需要有外源刺激因素的存在才能诱导IRF3转入核内发挥作用，支持细胞发挥免疫防御反应与细胞因子IL-1、IL-6密不可分。各组在0、12、24、48h检测IL-1、IL-6mRNA水平发现在一定量LPS刺激下没有时间依耐性，推断LPS刺激支持细胞发挥免疫防御作用可能主要是通过启动MyD88非依赖途径信号转导通路起作用，为下一步具体分析支持细胞LPS-TRL4信号转导通路的信号分子提供基础。实验二LPS刺激uPA转录区域在信号转导途径中的作用目的：本实验为了研究uPA基因是否主要是在MyD88非依赖性的NF-κB／IRFs信号转导通路中起作用，用LPS、anti-IRF3、IFN-β三个刺激因子分别在0、12、24、48h干扰支持细胞观察uPAmRNA及蛋白表达变化的情况，为进一步了解uPA基因在此信号转导通路中分子作用机制提供理论依据。了解基因启动子区重要的顺式调控元件和相关的反式作用因子以及核基因对于诱导信号的应答机制，明确调控uPA基因表达的靶标。方法：分别用空白对照、LPS、anti-IRF3、LPS+anti-IRF3、LPS+IFN-β、IFN-β6组对分泌uPA蛋白的支持细胞进行体外诱导，诱导作用时间分别为0、12、24、48h。诱导后以β-Actin为内参采用Real-time PCR与Western-blot方法检测uPAmRNA和蛋白水平。结果：（1）LPS+IFN-β组uPAmRNA表达水平较其它组都高，与LPS组比较没有统计学意义（P=0．347＞0．05）；LPS+IFN-β组uPAmRNA表达水平比IFN-β组多，差异具有统计学意义（P＜0．001）。（2）空白对照组uPAmRNA表达水平比LPS组、IFN-β组、LPS+IFN-β组、LPS+anti-IRF3组低，差异具有统计学意义（P＜0．01，P＜0．05，P＜0．001，P=0．0028＜0．01）。（3）LPS+anti-IRF3组uPAmRNA表达水平比anti-IRF3组高，差异具有统计学意义（P=0．001＜0．01）；LPS+anti-IRF3组uPAmRNA表达水平比LPS组低，差异具有统计学意义（P＜0．05）。（4）空白对照组uPAmRNA表达水平与anti-IRF3组比较没有统计学意义（P=0．77＞0．05）；LPS+anti-IRF3组uPAmRNA水平比LPS+IFN-β组低，差异具有统计学意义（P＜0．001）。（5）IFN-β组uPAmRNA表达水平比LPS+anti-IRF3组高，差异具有统计学意义（P=0．014＜0．05）；IFN-β组比anti-IRF3组uPAmRNA水平高，差异具有统计学意义（P＜0．01）。（6）IFN-β组与LPS+anti-IRF3组uPA蛋白表达量没有统计学意义（P＞0．05）。（7）LPS组刺激12h uPA蛋白表达量比24、48h多这与前期免疫细胞化学结果一致。LPS刺激组uPAmRNA表达水平12h与24h、12h与48h比较没有统计学意义。（8）在0、12、24、48h观察各组uPA的表达变化发现uPAmRNA与蛋白表达不具有时间依耐性。结论：在支持细胞中LPS与IFN-β诱导LPS-TRL4信号发生有协同作用。IFN-β诱导uPA表达量的增加，表明uPA可能在LPS-TRL4MyD88非依赖性的NF-κB／IRFs信号转导通路刺激细胞因子分泌途径中发挥作用。在LPS刺激下用anti-IRF3拮抗IRF3作用，uPAmRNA与蛋白水平降低，表明anti-IRF3拮抗IRF3后支持细胞对LPS具有抗性。LPS-TRL4信号转导途径中uPA发挥作用，其可能是由于在LPS刺激下uPA表达量增加而促进细胞外基质迁移作用发挥支持细胞的防御机制。大鼠支持细胞分泌细胞因子促进uPA蛋白的表达，在uPA基因转录区域有专一调控uPA基因特异DNA的结合位点，明确了调控uPA基因表达的靶标。