正常的心脏功能有赖于体内环境的稳定,有赖于体内众多活性物质对心脏功能的协调、精细调节。这些活性物质中许多都是通过其相应的与G蛋白偶联的受体,激活细胞内信号通路,最终通过不同途径调节心脏功能。其中,分别与Gi和Gq蛋白偶联的受体,以及激活这些受体的内源性活性物质在心脏功能调节中发挥重要作用,有重要的生理和病理学意义。与Gi蛋白偶联的受体中,乙酰胆碱和腺苷的受体颇为重要,而它们对心脏功能的调节方式之一是通过调节心肌细胞的内向整流钾离子通道功能。其中G蛋白门控内向整流钾通道GIRK (Kir3.1/Kir3.4)可被乙酰胆碱、腺苷等内源性活性物质激活进而影响心肌细胞功能。由Kir3.1和Kir3.4构成的GIRK通道在心房肌细胞的电活性中有重要作用,由于可以被乙酰胆碱激活因此又被称为IKACh。乙酰胆碱和腺苷等内源性活性物质通过激活与Gi蛋白相偶联的各自受体(M2,A1等)进而激活IKACh,由此介导ACh的负性频率和负性肌力作用和腺苷的抗心律失常作用。IKACh主要存在于心房肌细胞并发挥作用,对于心室肌细胞上是否存在IKACh以及IKACh对心室肌细胞兴奋性的作用存在争议。有研究表明在一些动物心室肌细胞中有GIRK通道的表达,而对心室肌细胞中GIRK通道的功能则所知很少。本实验室杨冀杰硕士在正常小鼠心室内膜下、外膜下细胞和心衰小鼠外膜下细胞中记录到明显的、成分可能为IK1的内向整流钾电流,同时发现腺苷可激活一种内向整流钾电流,因此电流可以被GIRK特异性阻断剂tertiapin阻断,因此认为此电流可能为GIRK电流。包括钾通道在内的离子通道是构成心肌动作电位的基础,而心肌动作电位又可以通过兴奋-收缩偶联而影响心肌功能。因此,本研究将在上述实验结果的基础上,进一步观察了GIRK通道是否参与了心室肌的功能调节作用。慢性心功能不全(充血性心力衰竭,congestive heart failure, CHF)是一种严重的心脏疾病,它是指在有充分的静脉回流的前提下,心脏排出血量绝对或相对减少,不能满足全身组织器官代谢需要的一种病理状态。血管紧张素II(AngII)、去甲肾上腺素(NE)、内皮素(ET)等内源性活性物质都可能参与心肌肥厚的发生。上述与心肌肥厚相关的内源性活性物质的明显共性是这些物质中的许多能激活Gq蛋白信号通路,这提示Gq蛋白信号通路可能在心肌肥厚的发生过程中发挥重要作用。事实上,由实验表明Gq蛋白介导的信号能促进乳鼠心肌细胞的肥大,在培养的心肌细胞中过表达野生型Gq蛋白可使心肌增生;而表达激活的突变体Gαq时,进一步增强了Gq信号,引起最初的心肌肥大,并最终发展为心肌坏死。这种现象在过表达Gαq的转基因动物中进一步得到证实。Gq激活后可通过磷脂酶C(PLC)水解细胞膜上的PIP2产生DAG和IP3,后者可激活细胞内钙库上的IP3受体而释放钙库中的钙。目前对于Gq通路激活后诱发心肌肥厚的详细机制还不很清楚,其中细胞内钙变化可能是主要的机制。有关Gq通路和细胞内钙变化的关系有很多争议之处,AngII、NE等内源性活性物质能增加乳鼠心肌细胞的钙震荡细胞内钙,但对成年鼠心肌细胞内钙的影响则不能肯定。本研究的第二部分将使用成年SD大鼠,观察AngII和NE对细胞形态学及细胞钙离子的影响,还将通过转染腺病毒来过表达Gαq,并观察过表达Gαq对心肌细胞形态的影响。一、与Gi蛋白相关的乙酰胆碱和腺苷对心肌细胞功能的影响目的:在非洲爪蟾的卵母细胞中表达内向整流性钾离子通道,研究钡离子对内向整流性钾离子通道的抑制性作用,以及乙酰胆碱和腺苷对小鼠心室肌细胞功能的影响。方法:(1) Kir2.1, Ki2.1 and Kir3.1/3.4通道的cRNA的体外转录:所用的Kir通道克隆到质粒载体pGEMHE中,用RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems- T7 Kit体外转录得来各种Kir通道的cRNA。(2)爪蟾卵母细胞的分离:爪蟾卵母细胞在含2mg/ml胶原酶的OR2液中振荡消化1.5至2小时,OR2液的成分为(mM)NaCl 82.5, KCl 2,MgCl2 1,HEPES 5(pH=7.4)。当细胞消化为单细胞后用ND96溶液反复进行清洗细胞,去除胶原酶。(3)在爪蟾卵母细胞上进行RNA注射:将各种离子通道cRNA根据其表达情况的不同,按每个卵母细胞2 ng/50 nl注射,注射后的细胞在含2.5 mM丙酮酸钠的ND96中18℃培养, 12小时换一次液,ND96溶液构成为(mM): NaCl 96,KCl 1, CaCl2 1.8, MgCl2 1, HEPES 5, pH 7.4。(4)记录电流:用双电极电压钳(two-microelectrode voltage clamp,TEVC)方法检测细胞电流,其中放大器为500B。研究Ba2+对Kir2.1、Kir2.3和Kir3.1/3.4通道电流的抑制情况。(5)分离小鼠心室肌细胞:用Langendorff灌流装置酶解的方法分离小鼠的心室肌,细胞消化液的组成: CaCl2 0.05 mmol/L, BSA 1mg/ml, Taurine 20 mmol/L, type II colagenase 0.5mg/ml。(6)检测心肌细胞功能:采用IonOptix单细胞动缘检测系统检测细胞收缩功能,给予电压15V,频率1Hz,波宽4ms的持续电刺激。结果:(1)质粒DNA的酶切线性化电泳分析:用合适的限制性核酸内切酶将环状的质粒DNA线性化,环状质粒电泳显示两条或两条以上的泳带;而线性化完全的质粒DNA电泳显示一条泳带。(2)体外转录RNA的电泳分析:转录出所有Kir通道的cRNA,用常规的琼脂糖凝胶电泳方法可得到一条清晰的RNA条带。(3)用Ba2+抑制表达的Kir通道:向卵母细胞注射RNA后的2~3天后,即可用TEVC方法检测到Kir电流。电流呈现明显的内向整流特性,用钾通道的阻断剂BaCl2可以抑制这些电流,但是不同通道间无明显区别。(4)乙酰胆碱和腺苷对心室肌细胞舒缩功能的影响:观察给予乙酰胆碱和不同浓度的腺苷后对心室肌细胞的收缩幅度、最大收缩和舒张速率的影响,没有发现这两种药物对细胞功能的影响有区别。结论:以爪蟾卵母细胞为表达系统,将体外转录得来的RNA以微注射方式注入卵母细胞可表达Kir通道,2~3天后用双电极电压钳方法可观察卵母细胞内表达Kir通道的电生理特性, Ba2+可通过与Kir通道的孔区结合而阻断Kir通道的钾电流,但是Ba2+对不同的Kir通道的作用没有明显区别。乙酰胆碱和腺苷不能显著影响心室肌细胞的收缩功能,因此,可能是GIRK通道对心室肌细胞的功能不能发挥重要作用二、与Gq蛋白相关的血管紧张素II对成年大鼠心室肌细胞形态和细胞内Ca2+的影响目的:在实验室建立培养成年大鼠心室肌细胞的方法;研究血管紧张素II对心肌肥厚和细胞内Ca2+的影响;研究过表达Gαq蛋白对心肌肥厚的影响。方法:(1)成年大鼠心室肌细胞的培养:在无菌的条件下分离成年大鼠心室肌细胞,用无血清的M199培养基进行培养。(2)过表达Gαq蛋白:用装载有Gαq基因的腺病毒转染心室肌细胞,利用蛋白免疫印迹实验(Western blot)验证Gαq蛋白的过表达。(3)观察细胞形态和细胞内钙离子的变化:计算培养的正常大鼠心室肌细胞、用血管紧张素Ⅱ孵育的细胞以及过表达Gαq的细胞的表面积。(4)使用钙荧光探针(Rhod-2AM)标记细胞内钙,利用激光共聚焦显微镜(LSCM)观察培养的大鼠心室肌细胞内钙的改变。结果:(1)培养的成年心室肌细胞的形态:分离的大部分正常心室肌细胞是长杆状的,有清晰的纹理,在培养的3天内不会有明显改变,3天后有些细胞出现形态学的改变,而有些细胞在5天内都能保持良好的状态。(2)给予血管紧张素II后,在培养的48h内细胞大小无明显改变,但是72h后细胞表面积明显增大。(3)过表达Gαq不会影响培养细胞的大小,但是过表达Gαq的同时用血管紧张素II孵育,其表面积在48h内就能明显增大。(4)急性给予血管紧张素II不会影响细胞内Ca2+浓度。结论:培养的成年心室肌细胞至少在3天内可以保持良好的形态学特征,大部分细胞在3-7天内可以保持相似的形状。使用血管紧张素Ⅱ孵育的成年心肌细胞,3天后出现肥大现象;当同时过表达Gαq时,这种现象更明显。血管紧张素Ⅱ对成年大鼠心室肌细胞内Ca2+无急性影响。总结1 Ba2+可阻断爪蟾卵母细胞上表达的Kir电流,但是对不同的Kir通道作用无明显差异。2乙酰胆碱和腺苷不能明显影响心室肌细胞的收缩功能,GIRK通道对心室肌细胞的功能不发挥重要作用。3无菌培养的大鼠心室肌细胞在3-7天内可以保持良好的形态学特征。4血管紧张素Ⅱ可以引起成年心肌细胞的肥大,当同时过表达Gαq时,这种现象更明显。5血管紧张素Ⅱ对成年大鼠心室肌细胞内Ca2+无急性影响。