血管内皮细胞位于血管内腔表面,是血管壁与血液之间的分界屏障细胞。它不仅是生物学上的结构与功能屏障,还是高度活跃的代谢库,能合成多种血管活性物质。血管内皮细胞的损伤和功能异常与多种疾病的发生相关或为始动环节,尤其在心脑血管性疾病发病过程中起到重要作用。在血管内皮细胞功能异常和损伤发生过程中,血管内皮细胞胞吐是最早发生的反应。血管内皮细胞受到炎症刺激时,它通过胞吐释放大量炎症性因子,诱导大量的白细胞、血小板粘附到血管内皮表面,加剧组织炎症与血栓的形成。内皮细胞胞吐已经成为研究血管功能异常和损伤发生机制的一个重要方面。　　 内皮细胞内贮存大量的颗粒,它们包含前炎症因子与前凝血因子,例如:P-选择素(P-selectin)、E-选择素(E-selectin)、血管内皮粘附分子-1(VCAM-1)和血管假性血友病因子(VWF)等,这些分子与细胞粘附、炎症及止血紧密相关。P-选择素介导中性粒细胞在活化内皮细胞上的滚动,尤其在炎症过程的早期(数分钟)甚为重要,在炎症晚期同其他选择素分子协同发挥作用。P-选择素还参与血小板和某些T细胞亚群的沿血管壁的滚动的过程。E-选择素主要介导白细胞(中性粒细胞、单核细胞和CD4+记忆性T细胞)在内皮细胞表面最初的滞留和滚动,以及随后迁移到炎症的组织。血管内皮粘附分子-1主要介导淋巴细胞、单核细胞嗜酸细胞和内皮细胞的粘附。它特异地与白细胞(除中性粒细胞外)所产生的整合素家族的粘附因子VLA-4结合,介导细胞粘附和信号传递,在细胞分化、炎症反应、动脉粥样硬化等多种疾病病理生理过程中发挥作用。血管假性血友病因子介导血小板粘附与聚集,启动血栓形成,特异性地反映血管内皮细胞功能的异常。许多促分泌剂都能刺激内皮细胞胞吐,例如:凝血酶,组胺,白三烯,补体等。根据胞吐是由钙介导还是CAMP介导,促分泌剂分为两类。目前研究最广的是凝血酶,它是一种钙调促分泌剂,它通过活化钙调蛋白升高细胞内钙离子浓度,导致快速的胞吐。凝血酶与位于内皮细胞表面的受体结合刺激血管内皮细胞释放P-selectin、E-selectin和VCAM-1,这一系列反应不仅推动凝血过程和血小板黏附,而且促进中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞在内皮下聚集,进一步使内皮细胞活化,刺激内皮收缩、通透性增加、黏附分子表达增加、白细胞滚动和穿透力加强。凝血酶刺激内皮细胞已经成为研究血管内皮损伤机制的一个重要模型。　　 内皮细胞的每个运输小泡的胞吐都经历装载,出芽,移位,对接,诱发,膜融合,及再循环这几个阶段。几套蛋白调节小泡的转运,包括Rab家族成员,N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白(NSF),可溶性的NSF附着蛋白,SNAP受体蛋白(SNAREs),Sec/Munc家族。NSF是调节胞吐的重要分子。它是由六个相同的亚基组成的六聚体,每个业基的分子量约85kD,各含三个结构域,分别命名为N、D1、D2结构域。NSF只有在三个结构域协同作用时才能最大限度地发挥自己的功能,其中N结构域主要与SNARE复合物结合,D1的ATP酶活性是NSF的主要功能,D2主要参与多聚体的形成,球形的N结构域环绕于环的外侧基底部。一氧化氮主要通过巯基业硝基化NSF的D1结构域的C264位的半胱氨酸残基,阻止NSF与SNAREs的解离,从而阻止胞吐。因此增加一氧化氮的产生就可抑制内皮细胞的胞吐,从而抑制细胞粘附,减缓血管炎症与血栓形成在内皮细胞。在内皮细胞,一氧化氮主要由内皮型一氧化氮合酶催化精氨酸合成一氧化氮。内皮型一氧化氮合酶的活化主要由磷脂酰肌醇3激酶.丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt(PI3K-Akt)信号通路调控。磷脂酰肌醇3激酶被激活后,在细胞膜上生成第二信使磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIPa),PIPa与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶结合,促使磷酸肌醇依赖性蛋白激酶磷酸化Akt蛋白的Ser308导致Akt的活化,Akt激活内皮型一氧化氮合酶,导致NO的产生。此外,内皮细胞粘附性增加,血管炎症发生也与炎症因子诱导的粘附分子大量表达密切相关。核因子-kappa B(NF-к B)信号通路调控许多粘附分子的表达。粘附分子VCAM-1和E-selectin基因的启动子区域存在NF-к B的结合位点。NF-к B是一种普遍存在于各种细胞中的核转录因子。NF-к B由两类亚基形成同源或异源二聚体。一类亚基包括p65(也称RelA)、RelB和C-Rel；另一类亚基包括p50和p52。最常见的NF-к B亚基组成形式为p65/p50或p65/p65。在正常状态下,NF-к B在胞质中与它的抑制因子-к B(I к B)结合在一起,失去转录活性。在炎症因子如凝血酶激活存在的情况下,I к B-α会在Ser32和Ser36被磷酸化,随后被泛素-蛋白酶体途径降解。NF-к B和I к B-α解聚后,其核定位序列被暴露,从而被转运到细胞核内,在核内与目的基因的启动子区域结合,促进NF-к B依赖的基因转录。　　 京尼平是桅子果实中的主要成分之一栀子苷在肠和肝中的水解产物,是栀子苷的苷元。栀子是我国的一种传统中药,具有泻火除烦,清热利尿,凉血散瘀的功效,被用于治疗热病心烦、火毒疮疡、外治扭挫伤痛、消渴目赤等症,在中医处方中应用甚广。栀子含有多种化学成分,药理实验表明,以栀子苷为代表的烯醚萜类成分为栀子的主要活性成分,它具有利胆、镇痛、保肝、抗癌、抗炎等作用。近年来研究发现栀子苷在体内的主要活性产物是京尼平。京尼平具有明显的抗炎与抗血栓作用。但作用机制尚不清楚,然而内皮细胞胞吐与抗炎和抗血栓有着密切的联系,提示我们京尼平可能具有抑制内皮细胞胞吐作用。　　 基于上述背景我们确定研究京尼平对人脐带静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelail cell,HUVEC)胞吐的作用及其机制。我们首先观察京尼半对内皮细胞的增殖作用,以确定下一步实验京尼平的合适剂量,用于研究京尼平对凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞胞吐的抑制作用。然后在细胞水平研究京尼平对凝血酶诱导的人脐静脉内皮细细胞与单核细胞的粘附抑制作用,以及在动物整体水平研究京尼平对小鼠尾静脉出血时间的影响。最后从一氧化氮的产生,磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt(PI3K-Akt)信号通路和核因子-kappa B信号通路的作用来研究京尼平抑制胞吐的分子机制。　　 结论:　　 一、首次发现京尼平抑制凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞细胞粘附分子、选择素和血管假性血友病因子的胞吐。　　 二、京尼平减少凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞与单核细胞的粘附,并且明显延长小鼠尾静脉出血时间。　　 三、京尼平通过激活PI3K,诱导Akt的磷酸化从而激活eNOS,增加一氧化氮的产生,促进NSF蛋白巯基亚硝基化,从而发挥抑制胞吐的作用。　　 四、京尼平明显抑制凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞VCAM-1和E-selectin mRNA和蛋白的表达以及细胞核因子-к B信号通路的活化。　　 综上所述,京尼平通过活化PI3K-Akt-eNOS信号通路,增加一氧化氮的产生,促进NSF蛋白巯基亚硝基化,从而发挥抑制胞吐的作用。同时它也能抑制核因子-к B信号通路从而抑制粘附分子的表达。京尼平通过影响上述两条通路,共同发挥抑制人脐静脉内皮细胞与单核细胞的粘附,以及延长小鼠尾静脉出血时间的作用。本研究为阐明京尼平抗炎和抗血栓的作用与分子机制提供了新的实验依据。