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背景及目的根据国家癌症中心最新公布的全国癌症统计数据,2015年间,全国共新发恶性肿瘤约392.9万例,发病率为285.83/10万,0-74岁累积发病率为21.44%,死亡率为170.09/10万。其中,我国发病率排前五名的肿瘤依次为肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌与肝癌,死亡率前五名则依次为肺癌、肝癌、胃癌、食管癌与结直肠癌。全球大约有半数食管癌发生在中国,中国食管癌患者病理类型以鳞状细胞癌为主。绝大多数患者会经历复发或转移,对于晚期食管癌患者,首选全身性化疗,然而由于化疗耐药及剂量限制性毒副反应,目前我国存在大量未被满足治疗的患者人群。因此,急需改进现有治疗措施,特别是寻找新型治疗模式,对于改善我们国家食管癌患者生存预后状态,具有重要现实意义。近几年来肿瘤免疫疗法已成为肿瘤治疗领域的焦点。美国免疫学家詹姆斯·艾利森(James Allison)和日本生物学家本庶佑(TasukuHonjo)凭借“发现负性免疫调节治疗肿瘤的疗法”获得了 2018年诺贝尔生理学或医学奖。与直接杀伤肿瘤细胞的传统治疗手段不同,肿瘤免疫疗法是利用人体自身免疫系统对肿瘤进行杀伤。其中,以PD-1/PD-L1单克隆抗体为代表的免疫检查点抑制剂在恶性黑色素瘤、肺癌、肠癌等诸多实体瘤中已被证实疗效确切,亦有多项临床试验结果证实,PD-1抗体在食管癌患者中具有可观疗效。最新NCCN指南指出,对于伴有微卫星高度不稳定/错配修复基因缺失(MSI-H/dMMR)的食管癌患者,抗PD-1抗体哌姆单抗可应用于二线治疗或后续治疗;对于PD-L1表达阳性的食管癌患者,哌姆单抗可作为三线方案选择。作为肿瘤免疫治疗的重要组成部分,PD-1抗体为广大患者带来明显生存获益,但也同时发生了许多耐药现象,而与治疗敏感以及耐药相关的具体分子机制仍然没有完全阐明,并已成为该领域研究重点。一直以来,研究人员致力于寻找PD-1/PD-L1抗体应用的疗效预测指标。有研究报道,PD-L1阳性率增加,通常与较好疾病控制率相关。但不同临床研究也存在不一致结果。在一些PD-L1表达阴性的晚期食管鳞癌患者中,接受PD-1抗体治疗后,同样观察到部分缓解与病情控制,提示其他机制参与PD-1抗体治疗敏感性及耐药机制调节。再者,肿瘤突变负荷(Tumor mutation burden,TMB)增高也与PD-1抗体治疗敏感性相关。Checkmate-026临床试验宣告失败后,研究人员采用肿瘤突变负荷TMB作为标志物对Checkmate-026试验进行回顾性研究,结果发现TMB作为标志物能更好地筛选出获益人群,在突变负荷高的患者群中,免疫治疗客观缓解率可达到47%(化疗组为28%),无进展生存期(Progression-free survival,PFS)为9.7个月,显著优于化疗组(5.8个月),但对于突变负荷低的患者群,化疗则优于免疫治疗。研究同时发现,肿瘤局部浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL)增加,免疫治疗效果增强,局部CD8+T细胞数量及比率增加的人群,接受PD-1抗体治疗后获益率更高。更多免疫治疗疗效预测相关研究正在持续进行当中。本研究目的在于从基础实验阐明二甲双胍调控食管鳞癌细胞PD-L1表达及改善局部CD8+T细胞杀伤肿瘤功能的机制,证实二甲双胍联合PD-1抗体治疗食管鳞癌的增效机制,为创新食管鳞癌免疫治疗新模式,改善食管鳞癌患者预后提供依据。资料及方法利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析食管癌中IL-6与PD-L1基因表达相关性;选取食管鳞癌细胞系KYSE-450和TE-7进行后续实验研究。通过酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验检测二甲双胍对食管鳞癌细胞IL-6分泌水平的影响;通过荧光定量PCR、蛋白印迹实验以及免疫荧光等实验方法,检测二甲双胍对IL-6下游信号分子JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平以及PD-L1转录水平及表达量的影响;同时设置IL-6阳性对照组,进一步证实二甲双胍调节食管鳞癌PD-L1水平与IL-6-JAK2-STAT3信号通路相关。通过敲除食管鳞癌细胞系AMPK分子或选用AMPK特异性阻断剂Compound-C,阻断AMPK-ACC信号通路,证实二甲双胍调控食管鳞癌细胞系PD-L1表达,与二甲双胍经典通路AMPK无关。分离外周血单个核淋巴细胞PBMCs,分别与经二甲双胍或IL-6预处理的食管鳞癌细胞系共培养,模拟肿瘤免疫微环境,采用ELISA方法检测T细胞IL-2分泌水平,western-blot方法检测T细胞ERK蛋白磷酸化水平,证实各预处理组T细胞激活水平改变。同时,行T细胞杀伤实验,证实二甲双胍下调食管鳞癌PD-L1表达后,局部T细胞杀伤肿瘤细胞功能增强。选取雄性NPI小鼠,尾静脉输注PBMCs,进行免疫人源化重建。同时,构建含荧光素酶转染细胞系TE7-luc,通过皮下接种,构建食管鳞癌移植瘤模型。实验分4组,每组小鼠5只,分别给以生理盐水、二甲双胍、PD-1抗体及联合用药,采用活体荧光成像系统观察移植瘤生长情况,免疫组化观察移植瘤PD-L1表达。同时,采用石蜡切片的免疫组织化学染色方法,检测2018年于郑州大学第一附属医院胸外科行手术治疗的食管癌组织切片,结合病史分为服用二甲双胍组与对照组,比较两组组织标本PD-L1表达水平。结果1.TCGA数据分析显示,食管癌组织中IL-6与PD-L1表达正相关。食管癌术后标本检测显示,服用二甲双胍与组织PD-L1低表达相关。2.细胞学水平检验显示二甲双胍降低食管鳞癌细胞系IL-6转录及细胞因子分泌,降低JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平。3.二甲双胍能够降低食管鳞癌细胞系PD-L1表达。4.食管鳞癌细胞与外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)共培养,二甲双胍预处理组T细胞激活水平更高,T细胞杀伤功能最强。5.动物实验证实二甲双胍下调PD-L1表达,联合二甲双胍与PD-1抗体,治疗效果最佳。结论二甲双胍通过阻断食管鳞癌细胞IL6-JAK2-STAT3信号通路,下调PD-L1表达,这一作用使得局部T细胞激活水平及杀伤肿瘤细胞功能变强,增强抗肿瘤免疫反应。动物实验证实,联合应用二甲双胍与PD-1抗体,能够增强抗肿瘤功效。为增强免疫治疗效果,改善食管鳞癌患者预后,创新食管鳞癌治疗模式提供新的理论依据。