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糖尿病(diabetes)是严重威胁人类健康的一类慢性代谢性疾病。胰岛素(insulin)是糖尿病临床治疗不可替代的药物,重组人胰岛素类似物在糖尿病治疗中的显著优势使之在临床得到广泛应用,特别是速效胰岛素类似物以其起效快和药效达峰时间短;可以很好地改善糖尿病患者对注射胰岛素药物的依从性;避免下餐前或黎明低血糖症发生几率而倍受糖尿病患者青睐,市场需求量大。不过,目前在临床应用的速效胰岛素药物仅有门冬胰岛素和赖脯胰岛素等几种,因而有必要开发新型速效胰岛素类似物和生产新途径。近年来,利用植物系统表达药用蛋白在降低生产成本、规模化生产和安全性方面与传统的大肠杆菌、酵母和转基因动物表达系统相比具有优势。基于此,本研究根据人胰岛素氨基酸(GenBank. AAA59172)序列和小C肽(TYPGDVPK)序列,按植物(油菜)偏爱密码子设计合成了198 bp编码普通人胰岛素原基因Des 30。随后以Des 30为模板,用PCR突变技术扩增并创造了基因B26H、B28D和B26H-B28D,并构建了4个原核表达载体: pET28a-Des30、pET28a-B26H、pET28a-B28D和pET28a-B26H-B28D。转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)后,经IPTG诱导、用Ni-NTA亲和柱纯化、复性、胰岛素体外成熟(酶解)和动物实验验证功能。取得了如下研究结果:1.基因设计合成与原核表达载体构建:根据植物偏爱密码子的原则设计并合成198 bp的普通人胰岛素原基因Des30,用PCR突变技术获得基因B26H、B28D和B26H-B28D;将目的基因插入载体pET28a相应位点,成功构建原核表达载体pET28a-Des 30、pET28a-B26H、pET28a-B28D和pET28a-B26H-B28D;2.胰岛素原类似物的诱导表达和纯化:用终浓度1 mM的IPTG诱导,4种胰岛素原类似物均成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并以包涵体形式存在;并用Ni-NTA纯化介质对目标蛋白进行纯化;3.胰岛素原类似物的复性与酶切:纯化的包涵体蛋白通过低温透析复性,然后用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,Western-blot结果显示,释放出的单体胰岛素与阳性对照一样具有免疫活性,MALDI-TOF质谱检测结果表明,酶切产物分子量分别与预测的人胰岛素类似物分子量一致。4.生物学活性检测:小鼠血糖实验数据表明,用大肠杆菌系统表达的B26H-insulin、B28D-insulin和B26H-B28D-insulin与临床常用的速效胰岛素NovoRapidR的降糖时效性与效果无显著差异(p<0.05),在给药20 min后就可以检测到降血糖功能,并在120 min达到最高峰;Dse30-insulin与临床用普通胰岛素(human-insulin)单体蛋白降血糖的趋势一致。该研究为后续利用植物系统表达临床大量需求的重组人胰岛素类似物的研究做了必要准备,也为探求速效胰岛素类似物的研发提供了新思路。