目的：构建小鼠成纤维细胞活化蛋白FAP的真核表达质粒,通过转染体外真核细胞系及免疫注射C57BL/6小鼠,综合评价该真核表达质粒在体外及体内表达的工作效率,并验证该重组表达载体作为核酸疫苗对于肿瘤相关成纤维细胞的杀伤效果以及对荷瘤小鼠胰腺癌肿瘤细胞增殖的抑制效应,从而为胰腺癌的预防和治疗提供一个新的手段和思路。方法：根据GenBank中小鼠FAP基因(NM 007986)全序列设计PCR引物,利用多聚酶链式反应获得其开放式阅读框(ORF)。将目的基因片段克隆至真核表达载体pcDNA6/myc-His-B,转化感受态大肠杆菌并筛选重组子。将重组质粒转染体外培养的HEK293细胞系,利用免疫荧光染色法(IF)及蛋白质免疫印迹(Western Blotting)检测外源性FAP蛋白是否能够在细胞中顺利表达。之后,通过分离并培养原代小鼠胰腺癌细胞及肿瘤相关成纤维细胞,利用小干扰分子RNA (siRNA)靶向沉默其内源性FAP蛋白的表达,利用实时荧光定量PCR(RTQ-PCR)、Western Blotting实验及免疫荧光(IF)实验来检测其靶向沉默的效果；同时利用噻唑蓝染色法(MTT)和流式细胞术(FCM)来检测当内源性FAP蛋白表达下调后,“原代胰腺癌-肿瘤相关成纤维细胞”共培养体系中,两种细胞的增殖和凋亡情况,明确FAP对于胰腺癌细胞及胰腺癌相关成纤维细胞增殖和生长的抑制作用。利用FAP真核表达质粒免疫C57BL／6小鼠,通过免疫组织化学(ICH)及RTQ-PCR方法检测其在小鼠体内的表达情况。最后,将小鼠胰腺癌细胞接种于小鼠皮下,分组：FAP免疫组、空白质粒免疫组和生理盐水对照组。而后监测瘤体体积、小鼠生命周期及瘤体组织中波形蛋白Vimentin(成纤维细胞标志)、角蛋白CK8(上皮细胞标志)及FAP的表达,来衡量FAP作为核酸疫苗是否可以预防和控制胰腺癌肿瘤细胞的增殖和生长,延长荷瘤小鼠的生存周期。结果：对于小鼠FAP的真核载体,经过酶切鉴定、测序比对,确定所筛选的阳性克隆为pcDNA6-mFAP重组子,其可在真核细胞HEK293中正常表达,并产生相应蛋白质产物。免疫荧光染色结果也表明,在转染pcDNA6-mFAP重组子的细胞中,其表现出明显的红色荧光(anti-Myc-CY3)和绿色荧光(anti-FAP-FITC),证实在其表面有FAP蛋白的表达；而对于空白质粒组和无转染组的细胞均无上述荧光表达。另外,Western Blotting结果也显示,转染pcDNA6-mFAP重组子的细胞总蛋白中,有抗FAP的条带与抗Myc的条带,而其他两组细胞均无此条带产生,故所有实验结果均表明,所构建的pcDNA6-mFAP重组子可以在体外培养的真核细胞中顺利表达外源性FAP蛋白。随后,本实验成功分离小鼠原代胰腺癌细胞和肿瘤相关成纤维细胞,并且建立了两者共培养体系模型。HE染色可见共培养体系模型中的胰腺癌细胞及肿瘤成纤维细胞共同生长。RTQ-PCR结果显示,转染了siRNA-FAP的共培养体系模型中,FAP蛋白的mRNA表达量(0.52±0.02,n=3)远远低于转染siRNA-MOCK的共培养体系模型(0.99±0.07, n= 3, P< 0.05, t test)及未转染任何分子的空白对照组共培养体系模型(1.01±0.10, n= 3, P< 0.05, t test),该结果具有显著的统计学差异。同样Western Blotting实验结果也显示,转染了siRNA-FAP的共培养体系模型中,FAP蛋白的表达量(27.18%±3.23%)远远低于转染siRNA-MOCK的共培养体系模型(61.58%±4.72%, P= 0.0317, t test)及未转染任何分子的空白对照组共培养体系模型(65.29%±4.78%, P= 0.0389, t test),该结果具有显著的统计学差异。实验结果表明,所设计的siRNA可以成功下调细胞内源性FAP的表达。此后MTT实验结果显示,siRNA-FAP转染组胰腺癌细胞的生长速率远远小于空白对照组和转染siRNA-MOCK的细胞组；而胰腺癌细胞的增殖抑制率从转染后第二天起即明显高于另外两组数据,差异具有显著统计学意义(P<0.01),且该增殖抑制率随时间的增长呈现负增长趋势,至第七天达峰值。另外,FCM结果也表明,转染了siRNA-FAP的细胞出现了明显的凋亡现象(42.31%±5.34%),其与未转染组相比(7.02%±2.11%),具有非常显著的统计学差异(P<0.01)。上述实验结果表明,FAP蛋白的表达下调会显著抑制小鼠胰腺癌细胞及肿瘤成纤维细胞的增殖和生长,并引起细胞的凋亡。最后,我们对C57BL/6小鼠进行FAP免疫,免疫荧光检测和RTQ-PCR结果都提示,注射了FAP真核表达质粒的小鼠,其组织中均有FAP的高表达,而空白质粒组和生理盐水组中未见相应蛋白表达。同时,通过对不同分组小鼠注射相应质粒后进行肿瘤细胞接种,进行免疫组化测定并计算其生存周期和瘤体体积测量。免疫组化结果显示：经FAP真核质粒免疫后的小鼠,其肿瘤相关成纤维细胞表面FAP蛋白的表达明显减弱,与生理盐水对照组相比,具有显著的统计学差异。同时,肿瘤上皮细胞标志CK8和成纤维细胞标志Vemetin的表达,也明显低于生理盐水对照组,具有非常显著的统计学差异。然而,注射空白质粒免疫组的小鼠,其肿瘤上的FAP、CK8及Vemetin三个蛋白的表达与生理盐水组相比无显著的统计学差异。肿瘤体积测量结果表明,经FAP核酸免疫过的小鼠,其成瘤的速率显著慢于未注射FAP核酸疫苗的对照组；而且,在4周内,FAP免疫组小鼠的肿瘤生长缓慢,肿瘤体积((长径×短径2)/2)增长不明显,其与注射生理盐水空白对照组相比,有显著的统计学差异。对于注射生理盐水空白对照组和空白质粒免疫组的老鼠,肿瘤生长迅速,而该两组的肿瘤体积之比不存在统计学差异。生存周期结果表明,经FAP免疫后的小鼠,生存率普遍提高,且第1、第2周均无死亡,第4周的存活数为6只。而生理盐水对照组和空白质粒免疫组的小鼠,至第2周开始陆续死亡,死亡的数量均大于FAP免疫组的小鼠,当到第4周时,生理盐水组和空白质粒组的存活数分别只有3只和5只,均少于FAP免疫组。结论：利用基因工程构建的FAP真核表达质粒可以顺利在体外培养的真核细胞中,及小鼠体内表达外源性FAP蛋白；同时,FAP作为核酸疫苗可以有效地预防和控制小鼠胰腺癌肿瘤细胞的体内增殖和生长,延长荷瘤小鼠的生存期。