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背景:2型糖尿病(T2DM)发病率、死亡率、经济消耗均较高,给社会和家庭带来了沉重的负担。既往关于T2DM的研究多重视胰岛素抵抗,口服药物也主要以胰岛素增敏剂和促胰岛素分泌剂为主。而在T2DM的发生、发展过程中β细胞功能失调和细胞凋亡起着至关重要的作用,目前尚没有药物能抑制β细胞凋亡和功能衰竭。而抑制MST1可能就是改善β细胞功能失调、抑制β细胞凋亡从而治疗T2DM的新靶点。临床及实验研究均证明针灸可有效干预T2DM。胰俞(胃脘下俞)、脾俞、肾俞是针灸治疗T2DM的常用穴,且三穴均位于胰腺同神经节段。本研究以此为出发点设计实验,观察电针"胰俞"、"脾俞"、"肾俞"干预T2DM动物模型,是否存在疗效差异,并探索电针三背俞穴是否通过MST1相关通路影响β细胞功能和凋亡。本实验聚焦于β细胞功能和β细胞凋亡,吸引大家对于其在T2DM发生发展中作用的重视;同时也更能体现出针灸相较于现有药物通过多途径干预T2DM的优势;MST1是调节β细胞功能和凋亡的多途径通路的上游指标,将研究聚焦于MST1,为针灸干预T2DM的研究提出新的着眼点,同时可从更宏观角度对针刺改善T2DM进行探究。此外,验证了针刺对于MST1的良性调节,可推动针刺对于T1DM疗效和干预机制的研究,从而扩大针灸的应用范围。目的:1.通过检测电针"胰俞"、"脾俞"、"肾俞"对T2DM模型大鼠体质量、空腹血糖(FBG)、口服葡萄糖耐量试验(OGTT)、糖化血清蛋白(GSP)、血脂、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛β细胞形态的影响,观察电针"胰俞"、"脾俞"、"肾俞"对T2DM的干预效果及疗效差异。2.通过检测电针"胰俞"、"脾俞"、"肾俞"对T2DM模型大鼠胰岛β细胞中MST1基因及蛋白表达、MST1裂解蛋白(clMST1)和磷酸化蛋白(pMST1)、BIM和caspase-3活化、PDX-1蛋白、INS基因和蛋白表达的影响,观察电针"胰俞"、"脾俞"、"肾俞"对T2DM模型大鼠胰岛β细胞凋亡和合成INS功能的影响,探究电针"胰俞"、"脾俞"、"肾俞"干预T2DM的作用机制及差异。方法:将48只雄性SD大鼠随机分为正常组8只和2型糖尿病造模组(简称"造模组")40只。造模组高糖高脂饲料喂养50天的基础上以35mg/kg.BW腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素(STZ)溶液以制造2型糖尿病模型。注射后72h尾静脉采血,以罗氏血糖仪检测随机血糖;注射STZ2周后对大鼠行OGTT。以随机血糖≥16.7mmol/L,OGTT2h后血糖≥11.1mmol/L的大鼠为成功造模大鼠,纳入后续试验。造模成功32只,根据血糖水平随机区组分组,分为模型组8只,电针胰俞组8只,电针脾俞组8只,电针肾俞组8只。各电针组每日干预1次,每次20min,6次/周,连续干预4周。每日观察记录大鼠的一般状况;每周末检测各组大鼠体质量和FBG;干预前后进行OGTT试验,计算曲线下面积。4周后麻醉处死,腹主动脉取血,离心取血清,以自动生化分析仪检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、GSP水平,以放免法检测血清INS水平。取部分胰腺组织,一部分多聚甲醛固定,以HE染色观察胰岛形态,并以免疫组化方法检测胰岛β细胞中MST1、clMST1、pMST1、BIM、caspase-3活化、PDX1、INS蛋白的表达水平;一部分液氮冻存,以Real-time PCR法检测大鼠胰腺组织中目的基因MST1及INS的表达水平。结果:1.血糖代谢相关指标:本实验结果显示:在干预4周期间,模型组大鼠体质量基本呈下降态势,4周后较干预前明显降低;而FBG一直维持在较高水平,4周后较干预前显著升高;GSP水平也显示其在过去2-3周内血糖维持在较正常组明显升高的状态;OGTT结果显示其在干预前后均较正常组葡萄糖耐量显著受损,且干预4周后OGTT曲线下面积较自身干预前显著升高,与FBG变化趋势一致;干预4周后HOMA-IR也显著高于正常组;总体而言,说明了干预期4周后模型组大鼠血糖升高,葡萄糖耐量受损和胰岛素抵抗情况恶化,T2DM有所进展。而电针胰俞组大鼠,在4周干预期间,体质量变化趋势同模型组一致,同时间点比较均没有显著差异;FBG较自身而言,在干预第1周末有显著下降,但在干预第2周末又有所回升,此后一直维持在较高水平;但与同时期模型组相比,电针胰俞组在干预第3、4周末FBG水平显著下降;GSP水平也显示其在过去2-3周内血糖平均水平较模型组是显著下降的;OGTT结果同FBG变化趋势一样,干预前后自身无明显变化,但在干预4周后曲线下面积显著低于模型组;干预4周后,电针胰俞组HOMA-IR较模型组显著下降;总体而言,电针胰俞穴干预T2DM模型大鼠4周,可显著抑制血糖升高,改善葡萄糖耐量受损和胰岛素抵抗状态的恶化,抑制T2DM的发展。电针脾俞组大鼠,在4周干预期间,体质量变化趋势同模型组、电针胰俞组一致,同时间点比较均没有显著差异;FBG较自身而言,在干预第1、2周末较干预前显著下降,但干预第3、4周又显著回升;与同时期模型组相比,干预每周末血糖水平均有下降,但差异不显著;GSP水平显示其在过去2-3周内血糖平均水平较模型组是显著下降的;OGTT结果同FBG变化趋势一样,干预前后自身无明显变化,干预4周后曲线下面积比模型组有所缩减,但差异不显著;干预4周后,电针脾俞组HOMA-IR较模型组显著下降;总体而言,电针脾俞穴干预T2DM模型大鼠4周,还是可以改善大鼠血糖升高和葡萄糖耐量受损、胰岛素抵抗状态恶化趋势的,只是不如电针胰俞穴显著。电针肾俞组大鼠,在4周干预期间,体质量变化趋势同模型组、电针胰俞组及电针脾俞组一致,同时间点比较均没有显著差异;FBG较自身而言,在干预第1周末有显著下降,但在干预第2周末又有所回升,此后一直维持在较高水平;与同时期模型组相比,电针肾俞组在干预第3、4周末FBG水平下降,但差异不显著;其在第2周末的FBG水平显著高于电针脾俞组,说明在第2周末时电针脾俞穴降血糖作用优于电针肾俞穴;GSP水平显示其在过去2-3周内血糖平均水平也较模型组是显著下降的;OGTT结果同FBG变化趋势一样,干预前后自身无明显变化,干预4周后曲线下面积比模型组有所缩减,但差异不显著;干预4周后,电针肾俞组HOMA-IR较模型组显著下降;总体而言,电针肾俞穴干预T2DM模型大鼠4周,同电针脾俞穴相似,还是可以改善大鼠血糖升高和葡萄糖耐量受损、胰岛素抵抗状态恶化趋势的,只是不如电针胰俞穴显著。2.血脂相关指标:本实验结果显示:T2DM模型组大鼠TC、TG、LDL水平均较正常组大鼠显著升高,而HDL水平与正常组大鼠无明显变化。这符合HFD/STZ造模大鼠的血脂代谢紊乱特点。电针胰俞穴干预T2DM模型大鼠4周,可降低其TC、TG和LDL水平,改善脂质代谢。电针脾俞穴干预T2DM模型大鼠4周,可降低其LDL水平,而对TC、TG、HDL水平无显著影响。电针肾俞穴干预T2DM模型大鼠4周,可降低TC和LDL水平,而对TG、HDL水平无显著影响。电针胰俞穴调节TG的能力优于电针脾俞穴;电针胰俞调节血脂紊乱的能力比电针脾俞穴和电针肾俞穴更为显著;这也可能是电针胰俞穴调节血糖作用比电针脾俞穴和电针肾俞穴更为显著的原因之一。3.胰岛素水平:本实验结果显示:模型组大鼠胰岛素水平与正常组无显著差异,而电针胰俞穴可显著降低T2DM模型大鼠胰岛素水平,电针脾俞穴、电针肾俞穴有降低胰岛素水平的趋势,但效果不显著。4.MST1相关机制指标:本实验结果显示:与正常组相比,T2DM模型组大鼠MST1基因和蛋白的表达增多,MST1蛋白的裂解和磷酸化水平升高,即MST1蛋白的活化增多;线粒体凋亡途径中促凋亡因子BIM蛋白和caspase-3裂解蛋白表达增多,即BIM和caspase-3的活化增强,细胞凋亡增多;PDX1蛋白的表达减少,INS基因和蛋白表达减少,即胰岛β细胞合成胰岛素的功能降低。电针胰俞穴、电针脾俞穴均可减少T2DM模型大鼠MST1基因和蛋白的表达,并显著抑制MST1蛋白的裂解和磷酸化,即抑制MST1蛋白的活化;从而进一步显著抑制线粒体凋亡途径中促凋亡因子BIM和caspase-3的活化,产生抑制细胞凋亡的效应。同时电针胰俞穴、电针脾俞穴均可显著促进PDX1蛋白的表达,并促进PDX1启动INS基因的转录表达,促进INS蛋白的表达,即促进胰岛β细胞合成胰岛素的功能。而电针肾俞穴可抑制MST1基因和蛋白的表达,并显著抑制MST1蛋白的裂解,对其磷酸化的影响效果不明显;但也可以进一步显著抑制BIM和caspase-3的活化,产生抑制细胞凋亡的效应。同时电针肾俞穴可显著促进PDX1蛋白的表达,但对于INS基因转录的影响不明显,却可以显著促进INS蛋白的表达,由此也可说电针肾俞穴亦可以促进胰岛β细胞合成胰岛素的功能。由此可见,电针胰俞穴、电针脾俞穴、电针肾俞穴均可以通过调节MST1相关基因和蛋白表达抑制β细胞的凋亡,促进β细胞合成胰岛素的功能。结论:1.电针胰俞穴、电针脾俞穴、电针肾俞穴干预T2DM模型大鼠4周,均可以抑制T2DM大鼠血糖升高、葡萄糖耐量受损、胰岛素抵抗状态恶化的趋势,均可从一定程度上改善血脂代谢;但电针脾俞穴和电针肾俞穴调节血糖、血脂代谢的能力不如电针胰俞穴显著。由此可见,胰俞在干预治疗T2DM上具有一定的优势和特异性。鉴于三穴均位于胰腺同神经节段内,但又与胰腺有不同节段联系,还不能确定电针胰俞、脾俞、肾俞干预T2DM起效的机制及疗效的差异与神经节段无关,但具体关系还有待进一步的探究。2.电针胰俞穴、电针脾俞穴、电针肾俞穴干预T2DM模型大鼠4周,均可通过抑制MST1基因和蛋白的表达,以及抑制MST1的活化,抑制β细胞凋亡,促进β细胞合成INS能力,进而发挥调节血糖、血脂代谢的作用。电针胰俞穴、电针脾俞穴、电针肾俞穴对机制指标影响无明显差异。胰俞干预T2DM的特异性机制还有待进一步探索。