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第一部分2型糖尿病缺血性脑卒中外周血调节性T细胞比例变化研究目的:通过临床样本及动物模型研究糖尿病与非糖尿病脑卒中调节性T细胞(Treg)的表达差异,探索影响2型糖尿病缺血性脑卒中预后的关键因素。材料与方法:本研究收集了27例患者,经CT或者MRI扫描确认为缺血性脑卒中。其中具有1年以上2型糖尿病的有13例,不具有2型糖尿病的14例。入组患者发病后24-48小时空腹抽取外周静脉血样,分离出单个核细胞,采用流式细胞检测CD4+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。另外,同窝C57BL/6J小鼠分为野生型及2型糖尿病组。2型糖尿病小鼠给予高脂饮食喂养四周,腹腔注射STZ 25mg/kg,持续5天,再高脂饮食喂养4周,测血糖水平大于300mg/d L造模成功。野生型小鼠则给予正常饮食。两组小鼠完成光栓大脑皮层急性缺血性脑卒中模型。并在3小时内经小动物7.0T磁共振扫描明确病灶。第24小时内眦取血流式细胞检测CD4+T细胞及CD4+CD25+Foxp3+的Treg细胞比例。研究结果:临床病例分析发现,糖尿病及非糖尿病缺血性脑卒中患者两组基本资料CD4+T细胞比例两组之间无统计学(P>0.05),Treg细胞比例在糖尿病缺血性脑卒中组显著降低(P=0.001)。小鼠缺血性脑卒中模型第24小时外周血流式细胞检测发现,野生型小鼠和2型糖尿病小鼠卒中后CD4+T细胞表达无统计学差异,而Treg细胞在2型糖尿病小鼠表达显著降低(P<0.01)。研究结论:本实验通过临床病例及脑卒中动物模型发现,2型糖尿病状态下Treg细胞表达比例显著降低。提示Treg可能是造成2型糖尿病缺血性脑卒中预后不良的因素之一。为进一步刺激内源性增殖Treg细胞干预2型糖尿病缺血性脑卒中提供了理论依据。第二部分内源性扩增调节性细胞干预糖尿病小鼠缺血性脑卒中关键分子事件的探究研究目的:探索内源性扩增调节性T细胞(Treg)干预糖尿病及非糖尿病小鼠缺血性脑卒中的作用,挖掘其关键分子事件。材料及方法:STZ诱导小鼠2型糖尿病模型(T2DM),与同窝野生型小鼠(WT)建立光栓法缺血性脑卒中模型。7.0T小动物磁共振行头部T2加权成像,确认病灶面积,大小及位置,模型建立成功则入组。模型建立3-6小时尾静脉注射CD28超激动剂(CD28SA)或者PBS。分组为:T2DM对照组(200μL PBS)、T2DM干预组(200μg CD28SA)、WT对照组(200μL PBS)、WT干预组(200μg CD28SA),于第1、3天行流式细胞术检测Treg细胞比例变化。第1、3、7天磁共振扫描评估病灶变化情况。第7天行神经行为学评分、血糖检测、并行脑组织切片染色、western blot及ELISA检测。研究结果:流式细胞检测发现卒中后第3天,糖尿病和野生型小鼠干预组外周血Treg细胞比例较对照组显著升高(P<0.05),且这种趋势在糖尿病小鼠更为明显(P<0.05)。卒中第7天两种小鼠CD28SA干预组脑梗死体积显著降低,神经功能明显改善,血糖水平有下降趋势但无显著差异。同时,M2型巨噬细胞/小胶质细胞数量在CD28SA干预组明显升高,MMP-9表达显著降低(P<0.05)。此外,促炎症因子TNF-a、IL-1b、IL-6在CD28SA干预组下调,而抗炎症因子TGF-b表达升高。研究结论:通过CD28SA内源性增殖Treg细胞能够使梗死灶体积减少,改善糖尿病缺血性脑卒中小鼠神经功能预后。内源性扩增Treg细胞能够显著降低MMP-9表达,升高M2型巨噬细胞/小胶质细胞比例。第三部分分子影像学手段监测内源性增殖调节性T细胞对糖尿病小鼠缺血性脑卒中的干预效果研究目的:运用智能型MMP及M2巨噬细胞/小胶质细胞光学分子探针,实时动态监测内源性增殖调节性T细胞(Treg)干预糖尿病小鼠缺血性脑卒中后,MMP-9及M2巨噬细胞/小胶质细胞变化过程,评估干预效果,为后续临床转化提供依据。材料及方法:STZ诱导2型糖尿病(T2DM)及同窝野生型小鼠(WT)建立光栓法缺血性脑卒中模型。7.0T小动物磁共振成像仪行T2加权成像,确认病灶面积,大小及位置,模型建立成功则入组。模型建立3-6小时尾静脉注射CD28SA或者PBS。分组为:T2DM对照组(200μL PBS)、T2DM干预组(200μg CD28SA)、WT对照组(200μL PBS)、WT干预组(200μg CD28SA)。缺血性脑卒中第1、3、7天分别尾静脉注射探针MMP-P12(8n M,200μL)或IRD-αCD206(0.5n M,200μL),行活体近红外荧光成像,并采用光谱分离技术采集图像。MMP-P12探针激发波长为675nm,发射波长为695nm。IRD-αCD206探针激发波长为745nm,发射波长为780nm。第7天行离体近红外成像并对脑组织切片行MMP-9、CD206免疫荧光染色。研究结果:MMP-P12智能型光学分子探针在小鼠体内15分钟即可在梗死区成像信号增强,1小时达到信号峰值。离体切片染色显示探针与MMP-9具有很好地共定位,说明MMP-P12探针能够用于在体检测MMP-9表达水平。近红外成像发现,在糖尿病小鼠中,内源性扩增Treg细胞能够在第3天就显著抑制MMP-9表达(P<0.05)。而野生型小鼠直到第7天才出现对照组和干预组之间的显著差异。IRD-aCD206光学分子探针在注射后的第8小时达到信号峰值,信号集中在脑梗死区域。离体切片发现信号与CD206阳性细胞(M2型巨噬细胞/小胶质细胞)共定位,说明IRD-aCD206探针能够反映M2型细胞水平。近红外成像显示,糖尿病小鼠的干预组TBR在第3天就显示了和对照组的显著性差异(P<0.05),而野生型小鼠则没有显著差别(P>0.05)。在第7天,糖尿病和野生型小鼠的TBR值在干预组显著升高(P<0.05)。研究结论:MMP-P12和IRD-?CD206探针能够在体监测MMP-9和M2型巨噬细胞/小胶质细胞表达水平,结合两种分子探针成像,能够实时、动态、无创评估内源性增殖Treg细胞的对缺血性脑卒中的干预效果。结果发现糖尿病小鼠内源性增殖Treg细胞后引起MMP-9下调及M2型巨噬细胞/小胶质细胞升高更快,更为敏感,提示糖尿病状态下缺血性脑卒中的可能治疗方案。