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猪是异种器官移植的优良供体,但从猪到灵长类的异种器官移植中,会发生免疫排斥反应,这也是异种器官移植研究中亟待解决的难题。敲除α-1,3半乳糖苷转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)供体猪的制备,基本解决了异种器官移植超急性免疫排斥反应。但补体介导的排斥反应,仍是机体排斥外源移植物的主要方式之一。高效表达人补体调节蛋白(Human complement regulatory protein,hCRP)基因hCD55、hCD46等,能有效地降低异种器官移植的免疫排斥反应。本研究采用随机整合的方法,在转入人膜辅助因子蛋白(Membrane cofactor protein,MCP)基因hCD46的GTKO巴马五指山杂交小型猪(Sus scrofa)耳成纤维细胞的基础上,转入人衰变加速因子(Decay accelerating factor)hCD55基因,获得了hCD55转基因猪1头;又采用定点敲入的方法,利用GTKO巴马小型猪耳成纤维细胞,转入hCD55基因,以期制备高效表达DAF的定点整合hCD55的耳成纤维细胞系。具体研究结果如下:1.转hCD55和hCD46克隆猪制备利用GTKO/hCD46巴马五指山杂交猪的耳成纤维细胞系,将人衰变加速因子蛋白基因hCD55随机整合到猪基因组中,制备表达人双补体调节蛋白的异种移植供体猪。构建广泛性表达启动子CAG调控的hCD55基因表达载体pCAGhCD55,转染猪耳成纤维细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞52个。PCR鉴定目的基因hCD55的整合情况,获得整合hCD55基因的克隆点27个。RT-PCR鉴定目的基因hCD55的表达情况,表达hCD55的克隆点有17个。选取表达较高的克隆点细胞,利用体细胞核移植技术制备hCD55转基因猪,选取596个融合胚胎移植4头代孕母猪,获得阳性仔猪1头。PCR鉴定克隆仔猪基因型(genotype),克隆仔猪成功整合hCD55基因。RT-PCR鉴定hCD55、hCD46的表达情况,结果显示,hCD55、hCD46基因在仔猪体内能正常表达。实时荧光定量PCR(qPCR)检测hCD55在转基因猪的各个器官中的表达量,检测发现hCD55基因在克隆仔猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、肌肉、小肠和大肠等器官都有表达,在肝脏、肺脏、肾脏中的表达水平较高。2.猪Rosa26位点敲入Loxp修饰的hCD55成纤维细胞系的建立高效表达人补体调节蛋白基因hCD55,在异种器官移植中尤为重要。本研究在GGTA1基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)巴马小型猪(Sus scrofa)耳成纤维细胞的基础上,利用CRISPR/Cas9技术在猪Rosa26基因座敲入hCD55基因,以制备hCD55基因高效表达的细胞系。分别构建靶向切割pRosa26(Reverse orientation splice acceptorβ-geo26,Rosaβgeo26)位点intron 1(内含子1)的Cas9表达载体,及pRosa26位点同源重组hCD55的表达载体,后者包含异源Loxp序列间的EF1α(polypeptide chain elongation factor 1α)启动子调控的hCD55基因、潮霉素B磷酸转移酶(hygromycin B phosphotransferase,HPH)基因、胸腺激酶(thymidine kinase,TK)基因为正负筛选基因。将Cas9-Rosa26表达载体和pEF1α-hCD55表达载体共电转染猪耳成纤维细胞系,培养液中加入丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)和潮霉素(Hygromycin,Hyg)进行筛选,培养至单细胞克隆,获得94个克隆点。利用跨5’端和3’端同源臂的两对引物PCR检测目的基因整合情况,定点整合hCD55的阳性克隆点2个。RT-PCR和Western blot检测hCD55在细胞中的表达情况,阳性细胞都能正常表达hCD55基因。结论:本研究利用GTKO/hCD46巴马五指山杂交猪的耳成纤维细胞系,成功制备了GTKO/hCD46/hCD55表达人双补体调节蛋白的异种移植供体猪;在GTKO巴马小型猪耳成纤维细胞系基础上,成功构建了定点整合并表达目的基因hCD55的细胞系。验证了克隆实验平台的稳定性,为异种移植供体猪的制备提供了资料基础。