锌(Zn)是生物体必需的微量元素。粮食作物中Zn含量偏低是导致许多发展中国家人体Zn缺乏的重要原因，因此提高作物中Zn向可食部位的转运和分配是解决人类Zn营养缺乏的重要途径之一。重金属ATPase(HMA，HeavymetalATPase)在植物中Zn的转运、分配和累积过程中均起着非常重要的作用，是调控作物籽粒Zn积累的一个重要候选基因。目前关于Zn转运相关HMA的研究较少，尤其是单子叶植物中更少，因此我们从小麦（高Zn品种京冬8号）中克隆了TaHMA2基因及其启动子区域，分析了其基本特征和功能，包括基因结构、表达模式、亚细胞定位、酵母功能互补分析等，将TaHMA2及其启动子分别转化单子叶和双子叶植物，进一步分析了其在植物体中的功能，尤其是在Zn、Cd转运和累积方面的功能。　　 TaHMA2基因及其上游调控序列的克隆　　 利用RACE技术从小麦中克隆了TaHMA2基因的全长cDNA、基因组DNA及上游调控区序列（起始密码子上游1043bp），并提交GenBank（序列号分别为HM021132.1、JN113581和JF489139）。该基因ORF编码1003个氨基酸，预测有8个（或6个）跨膜域，含有HMA家族的各类保守基序和功能域。比较其cDNA和基因组DNA序列发现该基因含有8个内含子。此外，本研究还克隆到两个与TaHMA2同源但具有大片段缺失的全长cDNA序列和两个与TaHMA2相似性较高的EST片段。　　 TaHMA2的重金属离子转运功能分析　　 TaHMA2与EGFP融合后转化洋葱表皮细胞，激光共聚焦扫描发现其融合蛋白主要定位在质膜上。将TaHMA2在Zn/Cd/Co/Ni敏感型酵母YK44中表达，发现其能提高酵母对Zn、Cd的抗性，但是不能提高对Co、Ni的抗性。结合其预测蛋白的结构分析，推测TaHMA2具有将Zn、Cd离子由胞内转运至胞外的功能。　　 TaHMA2基因的表达模式分析　　 TaHMA2基因的表达量在苗期小麦根部和地上部没有显著差异，但抽穗期该基因在茎节部位的表达水平较高。苗期小麦根部TaHMA2表达量在Zn、ABA、NaCl以及缺Zn处理时表现微量下调（600μMZnCl2处理时表现短时间上调，随后降低），其他胁迫下变化不明显。总体来讲，无论在不同组织水平或者不同胁迫下TaHMA2的表达量变化都很小，即该基因的表达是相对稳定的。　　 TaHMA2转基因植物的基本表型　　 由于作物的Zn营养调控可能会涉及到跨物种遗传调控，因此本研究分析了TaHMA2在各种植物中的功能表现。研究表明，该基因在水稻中的过表达增强了其伸长生长（根长、株高及穗长），但降低了其地上部的干物率和结实率，该现象在拟南芥、烟草和小麦中没出现。TaHMA2转基因水稻和小麦种子的萌发率与野生型无显著差异。　　 TaHMA2转基因植物营养体中Zn、Cd的含量与分布　　 TaHMA2转基因烟草的根中Zn含量略有下降，而地上部略有上升，但是差异不显著，根和地上部的Cd含量则与野生型无明显差异;TaHMA2在水稻中的表达导致了其根系和茎（包括叶鞘）中Zn含量的降低，而叶片中Zn含量则是上升的，Cd的分布变化与Zn类似，但是在某些株系中表现差异不显著;在小麦中过表达该基因时，其茎中（包括叶鞘）Zn、Cd含量降低，而叶片中则是升高的，这与水稻中的表现类似，但是转基因小麦根系的Zn、Cd含量与野生型相比无显著差异。TaHMA2在水稻和小麦中过表达均可提高Zn、Cd向地上部的转移率，不过小麦中Zn转移率的提高没有达到显著水平;转基因烟草中Zn、Cd向地上部的转移率也是升高的，但是也没达到显著水平;对其他重金属的转移率，三种转基因植物的表现并不完全一致。　　 TaHMA2转基因植物种子中Zn、Cd的含量与分布　　 TaHMA2转基因水稻和小麦种子中的Zn含量都表现显著下降，而Cd的含量与野生型无显著差异，且均低于0.05mg·kg-1DW。转基因烟草种子的Zn、Cd含量均与野生型无显著差异。转基因植物种子中Fe和Cu的含量有增加的趋势，尤其是烟草种子中Fe的增加较为显著。转基因水稻种子的胚、背侧糊粉层以及背侧和腹侧胚乳中的Zn都是显著低于野生型的，即种子各部位Zn含量的降低是造成其种子总Zn含量降低的原因。转基因小麦种子中胚、背侧和腹侧糊粉层中的Zn都是极显著的高于野生型的，而腹侧胚乳的Zn含量则显著低于野生型，因此腹侧胚乳Zn含量降低是其种子总Zn含量降低的主要原因。　　 TaHMA2转基因植物的Zn、Cd抗性分析　　 拟南芥中过表达TaHMA2可提高其对50μMZnCl2的抗性，但是当处理浓度达到400μM时，其抗性变化则与野生型无显著差异，此外其他重金属胁迫下转基因拟南芥与野生型的抗性表现也无显著差异;TaHMA2转基因烟草的根系相对生长速率(RelativeGrowthRate，RGR)在正常培养或者缺Zn培养时与野生型均无显著差异，但是在200μMZnCl2或100μMCdCl2处理时，其根系RGR则显著低于野生型;TaHMA2转基因水稻在正常培养时其根系和地上部的RGR均高于野生型，其根系RGR在缺Zn培养时要低于正常培养，这与野生型水稻的表现是相反的，但是在缺Zn条件下，转基因水稻的根系和地上部RGR仍然是高于野生型的。2mMZnCl2或200μMCdCl2处理时，转基因水稻根系RGR均显著低于野生型，其地上部RGR在Zn胁迫下高于野生型，Cd胁迫下则与野生型无显著差异。结果表明，TaHMA2的过表达可提高植株对中等强度Zn胁迫的耐受性（拟南芥），但是在高水平Zn或Cd胁迫下，转基因植株的抗性则显著低于野生型（烟草和水稻），此外TaHMA2还可提高水稻对缺Zn的耐受性。　　 TaHMA2转基因烟草和水稻在各种胁迫下的Zn、Cd含量与分布　　 在正常、缺Zn、高Zn和高Cd培养条件下，TaHMA2转基因水稻叶片中的Zn、Cd含量以及Zn、Cd由地下向地上部的转移率都是高于野生型的。此外，缺Zn培养时，转基因水稻中各部位的Cd含量均显著高于野生型。转基因烟草的Zn转移率在缺Zn培养时显著高于野生型，而正常培养或高Zn、高Cd培养时，其Zn、Cd转运效率与野生型均无显著差异。　　 TaHMA2上游调控序列与第一内含子的功能分析　　 生物信息学分析发现TaHMA2基因上游调控序列(1043bp)和基因的第一内含子序列(889bp)均含有启动子基本元件和一些其他顺式调控元件（例如组织特异性和各类环境调控元件）。分别构建上游调控序列(P)、内含子序列(F)以及二者结合序列(PF)与GUS相连的植物表达载体，转化拟南芥与水稻。分析发现，P、PF和F在水稻中均具有较强的表达活性，可在根、叶、穗轴（花轴）、果柄（花柄）、内外稃、花药等部位启动报告基因表达，尤其在维管组织较多的部位表达量更高，但是F在花药中的表达活性较低，其在根尖顶端部位则无表达活性;P和PF在拟南芥中的表达活性总体表现较弱，主要启动报告基因在茎节部位（包括基部茎节和其他茎节）表达，PF在拟南芥花器官（尤其是花药部位）中表达活性相对较高，而P在该部位没有表达活性。总体来讲，P和F在TaHMA2的表达调控上（尤其是组织定位）均有重要的作用，且很可能与金属离子的运输、分配有关;F在调控花器官中TaHMA2的表达上可能有特殊作用，可能与种子的发育有重大关系，其具体的功能有待于深入研究;此外，上述具有启动活性的调控序列在水稻中的表达活性比在拟南芥中要强的多，暗示了单子叶和双子叶植物基因调控区序列的功能差异。