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研究背景结肠癌是常见的消化道肿瘤,其发病率及死亡率呈逐年上升趋势,严重地威胁着人类健康。结肠癌是一个多基因、多阶段逐步演变的病理过程,其中抑瘤基因的失活和瘤基因的异常激活在结肠癌的发生、增殖、转移等过程发挥重要作用,因而寻找鉴定有价值的结肠癌相关抑瘤基因/易感基因,阐明其分子机制对揭示结肠癌发病机制,建立有效的分子诊治方法至关重要。NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室采用定位侯选克隆策略克隆的基因(基因登录号:AF188239),定位于染色体9p21-22,cDNA全长2.1kb,生物信息学分析该基因编码一个338个氨基酸的跨膜蛋白,具有两个跨膜结构,一个EGF-Like domain,多个糖基化位点和多个酪氨酸激酶磷酸化位点。9p21-22区域等位基因杂合性缺失(loss of heteroaygosity,LOH)现象是多种肿瘤中的共同事件,提示该基因为一肿瘤相关基因。在前期研究发现:NGX6在不同分期的结直肠癌中存在不同程度的表达下调,尤其在有转移的结肠癌中其下调率高达93.7%。通过细胞周期、细胞生长曲线、MTT比色法、软琼脂集落形成、裸鼠接种等实验表明NGX6基因可逆转结肠癌细胞的恶性表型;流式细胞术检测发现NGX6可延缓结肠癌细胞从G0/G1期向S期的进程,并可诱导结肠癌细胞的凋亡;体外侵袭转移实验和划痕标记染料发现NGX6可抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用。NGX6基因的上述生物学效应提示:NGX6在结肠癌中发挥着抑瘤作用。我们进一步采用基因芯片技术分析NGX6对结肠癌细胞基因表达谱的影响,结果提示NGX6可能调控EGFR介导的JNK通路和Wnt/β-catenin等信号通路的活性而发挥抗肿瘤增殖和转移作用;通过EMSA发现NGX6可能通过抑制结肠癌细胞NF-κB的激活而诱导结肠癌细胞凋亡;免疫共沉淀技术发现NGX6与ezrin蛋白结合,ezrin是一个“桥梁”蛋白,连接膜蛋白与细胞骨架,在细胞运动、信号传导两条通路上都扮演着重要角色,这一结果表明NGX6在调控细胞黏附及运动中可能占有重要地位。上述研究强烈提示NGX6在结肠癌中发挥抑瘤作用,基因水平的研究提示其抑瘤机制可能为NGX6结合ezrin负调控EGFR介导的相关信号通路的活性而发挥其生物学功能。研究目的生命的最终执行者是蛋白质,NGX6基因对结肠癌中蛋白质组的调控作用如何呢?这是本课题的切入点,目前尚无相关研究报道。本研究在前期工作的基础上,分析结肠癌细胞中NGX6转染前后的差异蛋白表达谱,在蛋白质水平阐明NGX6基因抑瘤的主要机制。研究方法应用荧光差异凝胶电泳(DIGE)和质谱分析技术比较结肠癌细胞HT-29中NGX6转染前后的蛋白质谱的表达变化。具体方法:1)提取细胞蛋白质,并进行Clean-up处理、测量蛋白质浓度,进行2D-DIGE电泳,利用Typhone扫描仪获取图像,Labscan扫面软件扫描进行图谱分析。2)经过图谱分析,以大于1.8倍为标准选取差异蛋白点,挖点,酶解,质谱鉴定差异蛋白质。通过查找差异蛋白质生物信息学功能,明确NGX6在蛋白质水平对结肠癌的抑瘤机制。研究结果结果筛选到12个下调蛋白:nucleolin、90kDa heat shockprotein、tubulin、HNRPH1、Annexin A2、HCRTR1 protein、microtubule-associated protein 6 isoform 1、guanine nucleotidebinding protein,beta-2 subunit、Chain A,Crystal Structure OfA Soluble Dimeric Form Of Oxidised Clic1、Chain A,MolecularBasis For The Recognition Of Phosphorylated AndPhosphoacetylated Histone H3 By、Chain A,Molecular Basis ForThe Local Confomat ional Rearrangement Of Human PhosphoserinePhosphata等,4个上调蛋白:aldehyde dehydrogenase 1、ChainA,X-Ray Structure Of A Deletion Variant Of Human Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Complexe、phosphoglycerate mutase1(brain)、fatty acid binding protein5(psoriasis-associated)等。并通过Western印迹验证了分子伴侣HSP90和AnnexinⅡ在NGX6基因转染HT-29细胞后的表达变化,与质谱分析结果一致。生物信息学分析上述蛋白的功能,发现其均与肿瘤的发生发展密切相关,按功能分类包括:细胞信号转导、细胞周期、细胞凋亡、细胞骨架、运动和细胞代谢。这些基因涉及到与肿瘤增殖、凋亡及转移相关的信号通路:如JNK/SAPK信号通路,Raf-1/MAPK信号通路,IKK/NF-κB信号通路,PI3K-Akt信号通路,凋亡信号通路Bcl-2家族以及Fas凋亡途径等信号通路。这些通路间通过“中间分子”形成复杂的网络调控系统。结论在结肠癌细胞中NGX6基因可改变细胞信号转导、细胞周期、细胞凋亡、细胞骨架、运动和细胞代谢相关蛋白分子的表达,通过影响这些蛋白分子可能调控MAPK、IKK/NF-κB、PI3K-Akt及凋亡通路的活性而发挥其抗肿瘤增殖、转移及促肿瘤细胞凋亡的作用。下一步的工作我们将深入揭示NGX6基因对上述主要信号通路的调控作用。