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目的椎间盘器官含有纤维软骨细胞数量较少,自我更新能力较弱,细胞外基质含量丰富,主要包括蛋白多糖和胶原等,构成细胞分布的支架。当椎间盘发生退变时,髓核水分丢失,软骨细胞逐渐发生凋亡,Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量进行性减少,终板软骨发生钙化,导致椎间盘退变进一步加重。因此,寻找何种种子细胞、细胞支架材料以及细胞因子,最终形成复合物移植并修复早期退变的椎间盘,已经成为目前脊柱外科研究热点之一。脂肪干细胞具有取材容易,量大,可反复取材,损伤较小,细胞增殖迅速等优点,而且已经证明其能够向脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞、软骨细胞等多向诱导分化。Ⅰ型胶原支架作为细胞载体,无抗原性,生物相容性良好,不产生毒性代谢产物,不影响内环境pH值,不影响细胞的生长增殖,安全性较高,是目前组织工程学常用的天然生物材料之一。生长分化因子-5,无论是体内还是体外试验均已经证明其能够促进椎间盘细胞合成聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白,达到修复早期椎间盘退变的目的。本实验采用Ⅰ型胶原支架作为细胞载体,体外三维培养条件下,应用GDF-5诱导脂肪干细胞成软骨细胞分化,为下一步将诱导后的类软骨样细胞复合生物材料支架植入退变的椎间盘中以修复早期椎间盘退变奠定实验基础。方法（一）脂肪干细胞的分离培养与鉴定及生物学特性研究1、兔脂肪干细胞的分离培养采用胶原酶消化离心法与贴壁培养法相结合,分离、纯化兔脂肪干细胞,进行体外培养扩增。2、细胞鉴定取第三代原代培养细胞,采用免疫组化和免疫荧光检测表面抗原标志CD44,CD49d,CD106表达并对其进行分析鉴定;用波形蛋白免疫组化染色方法鉴定并排除成纤维细胞干扰。3、生长曲线绘制倒置显微镜观察细胞的生长情况,MTT法测定第3,6代细胞的生长曲线。（二）GDF-5诱导单层脂肪干细胞成软骨细胞的实验研究1、观察经GDF-5诱导的脂肪干细胞形态学变化用倒置显微镜每日观察细胞的生长情况和形态学变化。2、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达采用免疫组化方法检测100ng/ml GDF-5在诱导2周时细胞浆中Ⅱ型胶原表达情况,采用阿利新兰和甲苯胺蓝染色检测诱导之后细胞间和细胞内中的蛋白多糖分布。3、检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达根据Genebank序列,设计引物,提取总RNA,利用RT-PCR方法检测不同浓度GDF-5在诱导7天、14天和21天时,Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达情况。（三）GDF-5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的实验研究1、观察细胞与支架的复合生长情况使用扫描电镜和冰冻切片HE染色观察100ng/ml GDF-5诱导第7天和14天时,细胞与支架复合情况和生长情况。2、检测复合于胶原支架上细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达。利用RT-PCR方法检测100ng/ml GDF-5在诱导7天、14天和21天时,胶原支架上的细胞表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的变化情况。结果（一）成功分离培养与鉴定脂肪干细胞1、原代培养显示原代细胞24小时之内开始贴壁,呈梭形、多角形分布,5天左右可达90%融合,10天左右细胞密度增高,呈旋涡状排列。传代培养细胞形态没有学太学变化。2、免疫细胞化学及免疫荧光检测显示MSCs表面抗原标志CD44,CD49d阳性表达,而CD106呈阴性表达,波形蛋白免疫组化染色呈阴性。3、绘制第3代和第6代脂肪干细胞生长曲线,提示第3代和第6代脂肪干细胞增殖能力没有显著性差异。（二）GDF-5成功诱导单层脂肪干细胞成软骨细胞分化1、倒置显微镜下观察诱导第7天时可见于细胞成圆形或类圆形,第14天时变化更为明显。2、阿利新兰结节染色呈阳性,但细胞本身不被染色;甲苯胺蓝染色细胞呈阳性;Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性。3、应用RT-PCR技术,证明脂肪干细胞经GDF-5诱导,Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA呈剂量依赖性表达;GDF-5在100ng/ml浓度下,细胞外基质含量在14天时候较多。（三）GDF-5成功诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞分化1、HE染色可见在支架表面上存在着大量细胞,细胞核呈蓝染。扫描电镜观察细胞黏附于胶原支架表面,细胞表面分泌大量颗粒物质。2、RT-PCR结果分析显示100ng/ml GDF-5诱导黏附于胶原支架脂肪干细胞向软骨细胞分化,使Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达明显增加。结论1、采用胶原酶消化离心法与贴壁培养法相结合从兔脂肪中分离提取的细胞具有干细胞的特性,并证实为脂肪干细胞,具有能够长期体外培养,生长稳定,增殖较快等特点。2、单层培养和复合于Ⅰ型胶原支架的脂肪干细胞经GDF-5诱导后,Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达含量明显增加,具有软骨细胞的部分生物学功能,同时也证明了Ⅰ型胶原支架与细胞的生物相容性良好。