苯环壬酯(phencynonate,PC,8021)和噻环壬酯(thiencynonate,TC,8012)是军事医学科学院毒物药物研究所研制开发的,具有自主知识产权的Ⅰ类创新手性药物和先导物。苯环壬酯和噻环壬酯的分子中均含有一个手性碳原子,分别具有两个对映异构体。前期研究表明,苯环壬酯和噻环壬酯均具有显著的抗M胆碱能受体的作用,其光学异构体之间的药理学活性有显著性差异。本实验室前期研究发现,苯环壬酯和噻环壬酯在大鼠体内的药代动力学特点和靶组织脑分布特征均具有一定的立体选择性差别。　　 本论文研究的目的是:建立手性拆分和测定苯环壬酯对映体及噻环壬酯对映体的方法；探讨其立体选择性药动力学产生的机理；阐明苯环壬酯和噻环壬酯在大鼠体内的主要代谢途径。为临床安全合理用药提供理论指导,为基于苯环壬酯、噻环壬酯的药物代谢产物和手性转换研制开发单一异构体新药物提供理论依据和新思路。　　 一、苯环壬酯和噻环壬酯对映体在大鼠肝微粒体中的立体选择性代谢　　 采用β-环糊精手性固定相色谱柱,建立并确证了拆分和测定生物样品中苯环壬酯对映体以及噻环壬酯对映体的手性液相色谱方法。　　 利用大鼠肝微粒体体外模型,研究了苯环壬酯对映体和噻环壬酯对映体的立体选择性代谢和手性转化。在大鼠肝微粒体中,苯环壬酯的浓度为100μM时,温孵120 min后,体系中L-对映体原型为(73.75±0.84)％,D-对映体原型为(46.28±3.73)％；苯环壬酯的浓度为200μM时,温孵180 min后,体系中L-对映体原型为(59.90±8.09)％,D-对映体原型为(29.69±2.05)％；苯环壬酯的浓度为400μM时,温孵180 min后,体系中L-对映体原型为(63.97±5.70)％,D-对映体原型为(45.46±2.72)％。噻环壬酯的浓度为100μM时,温孵120 min后,体系中L-对映体原型为(61.87±4.41)％,D-对映体原型为(15.35±2.38)％；噻环壬酯的浓度为200μM时,温孵180 min后,体系中L-对映体原型为(59.04±0.84)％,D-对映体原型为(15.47±1.91)％；噻环壬酯的浓度为400μM时,温孵180 min后,体系中L-对映体原型为(33.57±1.14)％,D-对映体原型为(75.89±1.68)％。结果表明,低、中、高三个浓度的苯环壬酯D-和L-对映体、噻环壬酯D-和L-对映体之间的代谢稳定性均存在着显著差异(P<0.05或0.01),其D-对映体代谢快,而L-对映体代谢慢。说明肝药酶是产生对映体的立体选择性代谢差异的主要因素,进而导致立体选择性药物代谢动力学的差异。　　 在大鼠肝微粒体温孵体系中,单独加入苯环壬酯或噻环壬酯的单一对映体,温孵180 min后,体系中没有检测出相对应的另一对映体。这说明苯环壬酯和噻环壬酯在大鼠肝微粒体系中温孵时,均未发生对映体构型的手性转化。　　 二、苯环壬酯和噻环壬酯对映体与血浆蛋白结合　　 应用平衡透析法研究了D-和L-苯环壬酯,D-和L-噻环壬酯分别与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和大鼠血浆蛋白的结合情况。D-和L-苯环壬酯的浓度分别为62.5、125和250μg/ml时,D-对映体与BSA的结合率为27.94％、24.29％和22.52％,与大鼠血浆蛋白结合率为64.03％、60.33％和54.65％。L-对映体与BSA的结合率为28.58％、29.01％和26.67％,与大鼠血浆蛋白结合率为64.46％、62.18％和56.02％。各对映体之间的蛋白结合率无统计学差异。　　 D-和L-噻环壬酯的浓度分别为62.5、125和250μg/ml时,D-对映体与BSA的结合率为65.07％、59.87％和48.30％,L-对映体与BSA的结合率为41.37％、39.31％和34.05％。D-对映体的BSA结合率高于L-对映体,并且存在显著性差异(P<0.01)。D-对映体与大鼠血浆蛋白结合率为86.62％、82.20％和64.30％。L-对映体的结合率为85.81％、81.14％和62.48％。其对映体之间与血浆蛋白的结合率无统计学差异。　　 在一定浓度内,苯环壬酯和噻环壬酯与血浆蛋白的结合率相对不高(<90％),且对映体之间的差异较小。因此可以表明,苯环壬酯和噻环壬酯的对映体与血浆蛋白的结合程度近似,对其体内立体选择性药动学差异的产生影响不大。　　 三、苯环壬酯和噻环壬酯对映体的跨膜转运　　 采用Caco-2单层细胞模型,在细胞水平研究了苯环壬酯和噻环壬酯对映体的跨膜通透性。结果表明,加药后120 min内,苯环壬酯对映体和噻环壬酯对映体,从绒毛面(apical side,AP)到基底面(basolateral side,BL)跨膜透过的药物量之间无显著性差异。提示苯环壬酯和噻环壬酯的体外吸收过程为被动吸收,不存在立体选择性差异。　　 使用VolSurf软件,通过化合物的三维分子结构来计算和预测苯环壬酯和噻环壬酯对映体的Caco-2单层细胞模型和血脑屏障(blood brain barrier,BBB)模型的跨膜透过性。D-和L-苯环壬酯的Caco-2细胞通透性计算值分别为0.869和0.773,血脑屏障通透性计算值分别为0.518和0.420。D-和L-噻环壬酯的Caco-2细胞通透性计算值分别为0.840和0.843,血脑屏障通透性计算值分别为0.598和0.730。Caco-2细胞通透性计算值大于0.7,血脑屏障通透性计算值大于0.4,提示苯环壬酯和噻环壬酯的对映体均可以通过Caco-2模型和血脑屏障模型。但是,由于对映体之间的透过值差异较小,说明苯环壬酯及噻环壬酯的对映异构体在大鼠体内的药代动力学差异主要不是来源于分子的被动跨膜转运。　　 四、苯环壬酯和噻环壬酯在大鼠体内的代谢转化　　 应用液相色谱-多级质谱联用(LC-MSn)方法,通过分别综合分析药物原型的代谢产物的准分子离子、多级碎片离子以及色谱保留时间,并与原型药物进行比对,研究了苯环壬酯和噻环壬酯在大鼠体内的代谢情况。共检测到10种苯环壬酯的代谢产物(N-去甲基单氧化产物(M1)、N-去甲基单羟基化产物(M2)、单氧化产物(M3)、单羟基化产物(M4)、双氧化产物(M5)、甲氧基化产物(M6)、双羟基化产物(M7)、双羟基化产物(M8)、羟基化甲氧基化产物(M9)和三羟基化产物(M10))和7种噻环壬酯的代谢产物(N-去甲基产物(M1)、N-去甲基单氧化产物(M2)、N-去甲基单羟基化产物(M3)、单氧化产物(M4)、单羟基化产物(M5)、单氧化单羟基化产物(M6)和双羟基化产物(M7)),同时观察到4种代谢途径,包括N-去甲基化、氧化、羟基化和甲氧基化代谢。　　 通过峰面积归一化法比较了对映体之间代谢产物的相对丰度(％)。D-苯环壬酯代谢产物的相对丰度分别为:11.57％(M1)、27.53％(M2)、10.24％(M3)、43.24％(M4)、0.90％(M5)、1.76％(M6)、0.99％(M7)、1.63％(M8)、0.87％(M9)和1.27％(M10)；L-苯环壬酯代谢产物的相对丰度分别为:12.65％(M1)、35.39％(M2)、7.72％(M3)、34.48％(M4)、1.02％(M6)、6.37％(M7)、1.28％(M8)、0.36％(M9)和0.73％(M10),代谢物M5未检出。D-噻环壬酯代谢产物的相对丰度分别为:D-噻环壬酯10.17％(M1)、9.16％(M2)、13.27％(M3)、30.09％(M4)、12.05％(M5)、10.38％(M6)和14.86％(M7)；L-噻环壬酯代谢产物相对丰度分别为:0.58％(M1)、12.72％(M2)、73.03％(M3)、2.12％(M4)、10.53％(M5)和1.02％(M7),代谢物M6未检出。结果表明,苯环壬酯和噻环壬酯的D-对映体与L-对映体各代谢产物的相对丰度和组成比例不同,其中以D-对映体的代谢产物的种类更加丰富,进一步显示体内药物代谢酶对药物D-对映体的立体选择性的生物转化作用更强。　　 五、苯环壬酯对映体药物代谢相关基因的表达水平　　 采用药物代谢PCR芯片(RT2 ProfilerTM PCR array)技术,研究了大鼠分别腹腔注射D-和L-苯环壬酯(1 mg/kg)后,其肝组织中Ⅰ相和Ⅱ相药物代谢酶类以及药物转运蛋白相关的mRNA表达水平。试验结果表明,p-糖蛋白(p—glycoprotein,p—gp)的相关基因Abcb1和Ⅰ相代谢P450酶类中CYP17A1、CYP1B1、CYP27B1、CYP2B6和CYP2C7基因表达水平,在D-苯环壬酯组均高于L-苯环壬酯组(fold change>1.5)。此结果进一步显示了D-和L-苯环壬酯在肝脏中的代谢过程存在立体选择性差异的基因选择机制。　　 综上所述,苯环壬酯及噻环壬酯的对映体在大鼠肝微粒体体外模型中的代谢稳定性存在显著性差异；在大鼠体内代谢产物的相对含量丰度和种类不同；苯环壬酯对映体激活大鼠肝脏中部分药物代谢酶的相关基因表达的水平存在差异。然而,苯环壬酯和噻环壬酯对映体以被动转运的跨膜吸收过程和血浆蛋白结合等对立体选择性药动学的影响不大。因此,苯环壬酯和噻环壬酯在大鼠体内的立体选择性药动学差异,主要产生于体内药物代谢酶催化的生物转化过程中的立体选择性差异。