目的:世界范围内,膀胱癌是泌尿生殖系第二高发的恶性肿瘤,严重危害人类健康。膀胱癌约90%为尿路上皮癌,起源于膀胱上皮细胞。侵袭性膀胱肿瘤具有肿瘤穿过基底层或侵及肌层的侵袭特性。临床上,根治性膀胱切除术仍是侵袭性膀胱癌最常用的治疗方式。尽管外科手术技术不断进步,但过去十年膀胱癌的生存率没有明显提高,五年肿瘤特异生存率仍大约为50%左右。因此,为了能够根据膀胱癌的生物学特性和行为选择个性化的治疗方案,进一步探讨潜在的分子靶基因有十分重要的意义。Tripartite motif-containing protein 24(TRIM24),又名转录调节因子(TIF 1α),是维甲酸信号通路的共调节因子。最近研究表明,TRIM24在几种人类肿瘤中存在过表达,其被发现参与急性粒细胞白血病、甲状腺乳头状癌,骨髓增殖综合征。TRIM24与染色质结合,激活基因转录,该机制与肿瘤细胞增殖和肿瘤进展有关。TRIM24促进前列腺癌的进展,且与乳腺癌病人的预后负相关。TRIM24在非小细胞肺癌中过表达,并且在胶质瘤中,其过表达促进了肿瘤细胞的化疗耐药。上述研究表明,TRIM24在肿瘤进展过程中是一个潜在的调节因子。截至目前,在TRIM24膀胱癌中的研究罕有报道,其生物学作用尚不清楚。本研究应用免疫组织化学的方法检测TRIM24蛋白在95例膀胱癌及癌旁组织中表达情况,并分析其表达与临床病理因素之间的关系,进而通过TRIM24过表达和基因沉默的方法进一步研究其在膀胱癌细胞系中的作用及潜在机制研究方法:1、收集2010年至2011年间于我院行外科手术切除,经病理证实为原发性膀胱癌并具有完整随访资料的石蜡包埋组织95例及相应癌旁组织。标本用10%中性福尔马林固定过夜,石蜡包埋,HE常规染色后经病理医师明确诊断。其中男68例,女27例,平均年龄57.1±12.5岁。根据2007WHO分类标准进行分期:Ta,T1,T2,T3,T4。患者术前均未接受放化疗。2、免疫组织化学染色方法检测抗TRIM24多克隆抗体在膀胱癌及对应癌旁组织中的蛋白表达差异,并进行统计学分析TRIM24蛋白表达与膀胱癌临床病理因素之间的关系。组织经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋后制成4μm连续切片,用链亲和素一过氧化物酶免疫组织化学法(SP法)染色。切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后,高温高压2 min,抗原修复。组织切片用3%过氧化氢浸泡20 min,灭活内源性过氧化物酶,且用正常山羊血清孵育以减少非特异性结合。组织切片用TRIM24兔多克隆抗体孵育(1:600稀释;Proteintech,USA),兔免疫球蛋白被用作阴性对照,两组抗体置于室温染色2小时,生物素标记的羊抗兔血清IgG用作二抗。PBS冲洗后,滴加链霉菌抗生物素蛋白.过氧化酶,孵育30 min,PBS冲洗3次,每次5min,DAB显色后,经苏木素核复染,梯度酒精脱水后,二甲苯透明,最后中性树胶封片。所有免疫组化切片均由两位有经验的病理医师在未知临床参数的情况下,独立阅片并计数细胞。每张切片在400倍显微镜下(10x40)观察并计数5个不同视野中共计100个癌细胞中的阳性细胞数,并计算平均阳性细胞率。TRIM24免疫组化阳性信号定位于细胞核。我们将1-25%的细胞核着色记为1分,26-50%记为2分,51-75%记为3分,76-100%记为4分。同时根据染色强度:棕褐色颗粒记为2分,黄色颗粒记为1分,无染色记为0分。着色细胞数得分及着色强度得分二者乘积为TRIM24表达得分。我们将得分<4分定义为TRIM24阴性,得分4-8分定义为TRIM24阳性。3、细胞培养和转染:T24、SV-HUC-1、BIU-87和5637细胞系来自American Type Culture Collection(USA)。在含有10%热灭活新鲜胎牛血清,100 IU/ml青霉素(Sigma,USA)和100μg/ml链霉素(Sigma,USA)的1640(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)培养基中培养。细胞在无菌培养皿中生长,且每2天用0.25%的胰蛋白酶处理。TRIM24的质粒购自Origene(USA),应用Attractene Transfection(Qiagen,Germany)将质粒转入细胞。空载体被用作阴性对照。转染48小时后收集细胞做后续实验。TRIM24的On-target plus SMARTpool siRNA和On-target plus Non-targeting siRNA购自Dharmacon(USA)。根据试剂盒操作说明,转染siRNA使用DharmaFECT1(ThermoFisher Scientific,USA)。4、Western blot分析:细胞的总蛋白用裂解缓冲液(Pierce,USA)提取,用Bradford法定量测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离50?g蛋白样品后,蛋白转印至PVDF膜(Millipore,Billerica,MA,USA),分别加入TRIM24(1:1000,Proteintech,USA)、Cyclin D1、Cyclin E、p-IκBα、IκBα、p-AKT、AKT(1:1000,Cell signaling,USA)以及GAPDH(1:2000,Santa Cruz,USA),且在4°C孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的抗兔/鼠IgG(Santa Cruz,USA)在37°C孵育2小时后,采用ECL(Pierce,USA)发光显色,用DNR Bio Imaging System(Jerusalem,Israel)检测。5、CCK8分析:转染后24小时,收集细胞,将细胞放置在含有10%胎牛血清培养液的96孔板中。培养12、24、36、48、60小时后,20μl CCK8溶液孵育细胞4小时后应用分光光度法进行测量,测量时波长设定为490nm。6、集落形成实验:细胞转染48小时后置入6 cm的细胞培养皿中(1000cells/dish),孵育12天。应用PBS溶液冲洗后应用Giemsa染色。显微镜下,人工筛选计数大于50个细胞的克隆集落数。7、Transwell侵袭实验:应用具有8μm小孔聚碳酸酯滤膜(Costar,USA)的24孔Transwell小室,上铺用20μl基质胶(1:3稀释,BD Bioscience,USA)。转染48小时后,对细胞进行胰蛋白酶消化,将含有细胞的无血清培养基(细胞数1×10~5/100μl,16h)加入上室中。将含有15%胎牛血清的培养液加入到下室中,孵育后,应用棉签小心除去在膜上层表面未侵袭的细胞,应用4%多聚甲醛固定后,苏木素染色,显微镜下观察计数侵袭过膜的细胞。8、统计分析:采用SPSS11.5统计分析软件,对TRIM24表达和临床病理因素之间的关系用χ~2检验,本实验其他结果采用t检验进行数据分析,用平均值±标准差(mean±SD)表示,P<0.05为差异有意义。结果:1、TRIM24在膀胱癌中阳性表达,且与临床病理分期及分化程度相关。⑴TRIM24在膀胱癌组织中的蛋白表达情况:采用免疫组织化学方法检测了TRIM24蛋白在95例原发性膀胱癌和相应癌旁膀胱组织中的表达情况,结果显示TRIM24蛋白在膀胱癌细胞中阳性表达,定位于膀胱癌细胞核;在正常的膀胱上皮中TRIM24蛋白呈阴性表达,而在膀胱癌组织中阳性率为41.1%(39/95)。⑵TRIM24蛋白过表达与膀胱癌的浸润深度和分级相关:我们分析了TRIM24阳性表达与膀胱癌临床病理参数的相关性,结果显示TRIM24阳性表达与浸润深度(T2–T4)(P=0.012)和肿瘤高分级(3级)(P=0.028)相关,但与性别、年龄、淋巴结转移情况无关。2、TRIM24在膀胱尿路上皮癌中的调控作用及潜在机制研究。⑴TRIM24在正常膀胱尿路上皮及尿路上皮癌细胞系中的蛋白表达:应用western blot法可见TRIM24在膀胱尿路上皮癌5637细胞系中高表达,在膀胱尿路上皮癌T24细胞系、BIU-87细胞系及正常膀胱尿路上皮SV-HUC-1细胞系中未见蛋白表达。(2)TRIM24过表达质粒转染BIU-87细胞及效果鉴定:TRIM24过表达质粒及空载体转染BIU-87细胞后,应用qRT-PCR法对比两组BIU-87细胞内TRIM24mRNA表达水平,应用GAPDH为内参,可见TRIM24过表达的BIU-87细胞内TRIM24 mRNA表达水平相对于空载体组明显提高(P<0.05)。Western blot法对比两组BIU-87细胞内TRIM24蛋白表达水平,应用GAPDH为内参,可见TRIM24过表达的BIU-87细胞内TRIM24蛋白表达水平明显提高。(3)TRIM24过表达提高BIU-87细胞增殖能力:应用CCK-8法分析,通过酶标仪检测,可见TRIM24过表达提高了BIU-87细胞的增殖能力。为了进一步验证TRIM24对BIU-87细胞增殖能力的作用,我们应用了克隆集落形成实验。结果提示,TRIM24过表达的BIU-87细胞明显可见更多的克隆细胞集落(P<0.05)。该结果进一步证实了TRIM24可以提高BIU-87细胞的增殖能力。(4)TRIM24过表达提高BIU-87细胞侵袭能力:应用Matrigel侵袭实验来验证TRIM24对BIU-87细胞侵袭能力的影响。结果可见,TRIM24过表达的细胞,其侵袭细胞的数量明显多于空载体转染细胞(P<0.05)。提示TRIM24提高了BIU-87细胞的侵袭能力。(5)TRIM24对BIU-87细胞增殖及侵袭的潜在调控机制:应用Western blot法检测两组细胞的AKT、IKT两、Cyclin D1和Cyclin E的蛋白表达水平,同时检测两组细胞AKT和IKT表磷酸化程度变化,以GAPDH为内参。可见TRIM24过表达的BIU-87细胞中,Cyclin D1和Cyclin E的蛋白表达增高,提示TRIM24通过Cyclin家族来调控BIU-87细胞的增殖。同时,TRIM24过表达的BIU-87细胞中,AKT和IKT,的磷酸化水平增高,而总蛋白未见明显改变,并且在应用NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082后,明显降低了TRIM24对Cyclin D1上调作用,提示TRIM24可以激活AKT和NF-κB通路来调控BIU-87细胞的侵袭能力,发挥其生物学效应。3、TRIM24作为膀胱尿路上皮癌潜在基因治疗靶向的研究。(1)TRIM24 siRNA转染5637细胞及效果鉴定:TRIM24 siRNA质粒及空载体转染5637细胞后,应用qRT-PCR法对比两组细胞内TRIM24 mRNA表达水平,应用GAPDH为内参,可见TRIM24 siRNA的细胞内TRIM24 mRNA表达水平相对于空载体组明显降低(P<0.05)。Western blot法对比两组细胞内TRIM24蛋白表达水平,应用GAPDH为内参,可见TRIM24siRNA的5637细胞内TRIM24蛋白表达水平明显下降。(2)TRIM24 siRNA抑制5637细胞增殖能力:应用CCK-8法分析,通过酶标仪检测,可见TRIM24 siRNA抑制了5637细胞的增殖能力。为了进一步验证TRIM24对5637细胞增殖能力的作用,我们应用了克隆集落形成实验。结果提示,转染TRIM24 siRNA的5637细胞明显可见克隆细胞集落数目减少。该结果进一步证实了对TRIM24进行基因沉默可以抑制5637细胞的增殖能力(P<0.05)。(3)TRIM24 si RNA抑制5637细胞侵袭能力:应用Matrigel侵袭实验来验证TRIM24 siRNA对5637细胞侵袭能力的影响。结果可见,TRIM24 siRNA转染的细胞,其侵袭细胞的数量明显低于空载体转染细胞(P<0.05)。提示对TRIM24基因沉默抑制了5637细胞的侵袭能力。(4)TRIM24 siRNA对5637细胞增殖及侵袭的潜在调控机制:应用Western blot法检测两组细胞的AKT,IκBα,Cyclin D1和Cyclin E的蛋白表达水平,同时检测两组细胞AKT和IκBα磷酸化程度变化,以GAPDH为内参。可见TRIM24 si RNA的5637细胞中,Cyclin D1和Cyclin E的蛋白表达下降,提示TRIM24 siRNA通过抑制Cyclin家族蛋白表达来抑制5637细胞的增殖。同时,转染TRIM24 si RNA的5637细胞中,AKT和IκBα的磷酸化水平降低,而总蛋白未见明显改变,提示TRIM24 siRNA可以抑制AKT和NF-κb通路来调控5637细胞的侵袭能力,发挥其生物学效应。结论:1、TRIM24在膀胱癌组织中过表达,且与临床病理分期及分化程度相关。2、TRIM24可以增强膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力,可能通过激活AKT和NF-κB信号通路,进一步激活Cyclin家族蛋白来发挥其生物学效应。3、基因沉默TRIM24可以降低膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力,可能通过抑制AKT和NF-κB信号通路,进一步抑制Cyclin家族蛋白来发挥其潜在治疗作用。