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研究目的:获得兔源HER2抗体的重链与轻链基因,合成单链抗体ScFv,通过噬菌体侵染构建完整的噬菌体单链抗体库。分别使用酶标板包被抗原与HER2阳性乳腺癌组织切片免疫组化两种方法筛选高亲和力HER2抗体,从特异性抗体库的富集倍数与阳性率两个方面比较两种方法筛选效果,探究以组织切片作为固相载体在噬菌体文库筛选方面的应用。研究方法:使用HER2蛋白免疫新西兰大白兔,提取脾脏总RNA,逆转录合成cDNA。设计兔源简并引物,以cDNA为模板PCR扩增出HER2抗体重链和轻链可变区基因序列,引入Linker随机拼接二者获得ScFv片段。通过双酶切及定向克隆技术获得pCANTAB5e-ScFv重组质粒,将其转化TG1感受态细胞;以辅助噬菌体M13K07侵染转化后的宿主菌TG1,从而构建兔抗HER2单链抗体噬菌体文库。分别使用酶标板包被抗原与HER2阳性乳腺癌组织切片免疫组化两种方法,依照“吸附-洗脱-扩增”流程进行筛选,经过5轮筛选获得终极抗体库,菌液PCR鉴定阳性克隆,Phage-Elisa鉴定重组抗体亲和力。通过Immunoglobulin(IG)及Nucleotide BLAST分析软件对所获得重链、轻链基因序列进行同源性比对。实验结果:1、成功提取脾脏总RNA,VH、VL拼接获得完整ScFv基因。2、构建的兔源HER2单链抗体库库容为1.68×106,重组率为83.3%。3、使用两种方法,经过5轮淘筛,产率逐渐升高,特异性噬菌体得到了有效富集,酶标板作为固相载体筛选的抗体库特异性增长了约105倍,HER2阳性乳腺癌组织切片作为固相载体筛选的抗体库特异性增长了 4180倍。4、HER2组织切片筛选出的特异性抗体库阳性率为60%,也高于酶标板筛选出的特异性抗体库25%的阳性率。对比富集倍数及阳性率,组织切片作为固相载体淘筛噬菌体库效果更好。5、选取两株反应较好的阳性克隆测序,所获得重链可变区基因与兔源抗体基因同源性为95.4%,轻链可变区基因同源性为91.4%,二者皆属于V1基因家族,序列结构完整。结论:成功构建大容量的兔源HER2单链抗体库,筛选出亲和力较高的特异性抗体,组织切片作为噬菌体展示文库的固相载体、免疫组化筛选方法可行,且筛选效果比酶标板筛选更好。