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肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是以肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)静息胞浆游离Ca2+浓度(intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i)增高、肺血管增生和重塑为主要特征的一种疾病。近来研究表明野百合碱(monocrotaline,MCT)致PAH大鼠PAs的钙池操纵性钙内流(sotre-operated calcium entry,SOCE)增加,在PAH胞浆内Ca2+增高起重要的作用。胞浆内Ca2+激活钙调神经磷酸酶(Calcineurin,Ca N,PP2B),后者引起胞浆内活化T细胞核因子(Nuclear Factor of Activated T Cells,NFAT)去磷酸化并转位入核,从而影响细胞的功能。本研究在MCT诱导PAH大鼠模型基础上,首先观察Ca2+-Ca N-NFAT信号通路在MCT致PAH大鼠发病过程中的作用以及MCT致PAH大鼠PASMCs的增殖、迁移和凋亡等功能的变化;在细胞水平予Ca N抑制剂环胞素A(cyclosporin A,Cs A)和采用si RNA瞬时转染沉默NFATc2/3/4的表达,观察大鼠PASMCs增殖、迁移和凋亡的变化,以进一步明确Ca N-NFAT信号通路信号分子的作用;在动物水平予Cs A或人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)治疗MCT诱导PAH大鼠3W,观察Cs A或Rb1对MCT诱发的大鼠PAH的防治作用并探讨可能的机制,并进一步证实Ca2+-Ca N-NFAT通路在PAH中的作用,以期为PH治疗提供新的靶向药物。第一部分MCT致PAH大鼠PASMCs的Ca2+-Ca N-NFAT信号通路的变化及增殖、迁移和凋亡的影响目的:观察Ca2+-Ca N-NFAT信号通路在MCT致PAH大鼠致病过程中的作用以及MCT致PAH大鼠PASMCs增殖、迁移和凋亡的变化。方法:SD大鼠予MCT按50 mg/kg剂量一次性腹腔注射饲养3W建立PAH大鼠模型,采用:(1)血流动力学和肺动脉形态学检测方法,测定大鼠右心室收缩压(right ventricular systolic pressure,RVSP)、平均右心室内压(pulmonary arterial pressure,RVP)、右心重量指数(right ventricular mass index,RVMI)和肺动脉(pulmonary arteries,PAs)形态的变化;(2)Fluo-3荧光检测[Ca2+]i方法,测定CPA诱导PASMCs胞膜[Ca2+]i升高的作用;(3)荧光定量PCR、Western Blot和免疫荧光等检测方法,测定PAH大鼠PASMCs的Ca N、NFAT m RNA和蛋白表达的变化;(4)MTS和PCNA法,测定PASMCs的增殖情况;(5)transwell小室测定PASMCs的迁移情况;(6)Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测PASMCs的凋亡。结果:与正常对照组相比,(1)MCT模型大鼠的RVSP、RVP和RVMI均显著增高,肺内小动脉管壁增厚,管腔狭窄,提示成功建立MCT致PAH大鼠模型;(2)经CPA诱发后MCT组的[Ca2+]i升高幅度显著增高,提示PAH大鼠PASMCs SOCE功能增强;(3)MCT致PAH大鼠PASMCs的Ca NBβ-NFATc2/3/4m RNA和蛋白表达明显增高,提示PAH上调Ca NBβ和NFATc2/3/4的表达;(4)MCT致PAH大鼠PASMCs促进增殖和迁移、抑制凋亡,推测可能与PAH大鼠PASMCs NFAT介导的功能增强有关。结论:MCT可诱导大鼠产生PAH,其机制可能是MCT致PAH大鼠PASMCs的SOCE功能增强,Ca NBβ-NFATc2/3/4表达上调,引起NFATc2/3/4介导的PASMCs增殖活性和迁移能力增强、凋亡减少,导致[Ca2+]i增高、血管平滑肌增殖和血管重塑,SOCE功能增强可能是产生PAH的启动因素。第二部分Ca N-NFAT信号通路对大鼠PASMCs增殖、迁移和凋亡的作用目的:在细胞水平观察Cs A和si NFATc2/3/4对CON和MCT致PAH大鼠增殖、凋亡和迁移的影响,以进一步明确Ca N-NFAT信号通路信号分子在MCT致大鼠PAH发生发展中的作用。方法:CON组和MCT致PAH模型组的大鼠PASMCs原代培养,予15、30和60μMCs A干预,或si RNA转染沉默NFATc2/3/4,对照组只加Lipofectamine?RNAi MAX转染试剂即MOCK组,si NFATc2/3/4组转染分别针对大鼠NFATc2/3/4基因的si RNA,采用:(1)荧光定量PCR和免疫荧光检测方法,测定si NFATc2/3/4转染大鼠PASMCs后NFATc2/3/4 m RNA和蛋白表达水平的变化,以验证干扰效果;(2)MTS法和PCNA法,检测Cs A干预或si NFATc2/3/4干扰后对大鼠PASMCs的增殖变化;(3)transwell小室测定Cs A干预或si NFATc2/3/4转染组对大鼠PASMCs的迁移情况;(4)Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测PASMCs的凋亡情况。结果:(1)Cs A对PASMCs增殖抑制作用的IC50分别为34.73±2.23μmol/L(CON组)和23.29±1.09μmol/L(MCT组);(2)CON组和MCT组,Cs A干预均呈剂量依赖性(15μM、30μM、60μM)抑制PASMCs的增殖和迁移,且MCT组抑制效应较CON组更为显著。(3)CON组和MCT组,均只在60μM Cs A干预显著抑制细胞凋亡,其抑制效果在CON组更明显,提示MCT致PAH大鼠PASMCs,Ca N可通过促进增殖和迁移作用、抑制和凋亡参与肺血管重构。(4)在CON和MCT组,si NFATc2/3/4转染均显著降低PASMCs NFATc2/3/4 m RNA和蛋白的表达,提示转染成功;(5)在CON组和MCT组,si NFATc2/4转染组均显著抑制PASMCs的增殖和迁移、促进细胞的凋亡,提示PASMCs中,NFATc2/4可促进增殖和迁移、抑制凋亡;(6)在CON组,si NFATc3干扰对CON组PASMCs的增殖、凋亡和迁移没有影响,而在MCT组,si NFATc3沉默显著抑制PASMCs的增殖和迁移、并促进细胞的凋亡,提示NFATc3可能不参与正常大鼠PASMCs的增殖和迁移,但在MCT致PAH大鼠的PASMCs中,NFATc3可能是促进细胞增殖的一个因素。结论:Ca N-NFAT信号通路信号分子参与PAH的发病过程。Ca N参与PAH的PASMCs的增殖活性和迁移能力的增强。NFATc2/4是大鼠PASMCs的生长和增生所必需的,而NFATc2/3/4可能参与PAH血管平滑肌的增殖和血管重塑,推测NFATc3对PAH的PASMCs的增殖和迁移更为重要。第三部分环孢素A和人参皂甙Rb1干预对MCT致PAH大鼠PASMCs的增殖、迁移和凋亡的影响目的:从动物水平观察Cs A或Rb预处理对MCT致PAH大鼠PASMCs增殖、凋亡和迁移的影响,以进一步明确Ca N-NFAT信号通路在大鼠MCT致PAH发病过程中的作用,为PH治疗提供新的靶向药物。方法:大鼠以50 mg/kg MCT单次腹腔注射,在造模的第一天同时予以25mg/kg Cs A或40 mg/kg Rb1,每天腹腔注射共21d,之后原代培养PASMCs,采用:(1)血流动力学和形态学检测方法,测定大鼠RVSP、RVP、RVMI和PAs形态的变化;(2)Fluo-3荧光检测[Ca2+]i方法,测定CPA诱导大鼠PASMCs胞膜[Ca2+]i升高的作用;(3)荧光定量PCR、Western Blot和免疫荧光检测方法,测定大鼠PASMCs Ca N-NFAT m RNA和蛋白表达水平的变化;(4)MTS和PCNA法,测定大鼠PASMCs的增殖情况;(5)transwell小室测定大鼠PASMCs的迁移情况;(6)Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测大鼠PASMCs的凋亡。结果:与MCT组相比,(1)Cs A干预MCT大鼠(Cs A-MCT组)的RVSP、RVP和RVMI显著降低,而且肺内小动脉管壁变薄,管腔增大,提示Cs A干预能抑制MCT致PAH大鼠模型;(2)Cs A-MCT组PASMCs的NFATc3/4蛋白表达显著下降,提示Cs A干预抑制PAH的NFATc3/4表达上调;(3)Cs A-MCT组的PASMCs增殖和迁移能力降低、凋亡水平增强,提示Cs A可通过抑制Ca N-NFAT信号通路逆转PAH的肺动脉重构。与MCT组相比,(1)Rb1干预MCT致PAH大鼠(Rb1-MCT组)的RVSP、RVP和RVMI显著降低,肺内小动脉管壁变薄,管腔增大,提示Rb1干预能抑制MCT致PAH大鼠模型;(2)Rb1-MCT组的PASMCs Ca NBβ-NFATc2/3/4m RNA和蛋白表达降低,NFATc1/5 m RNA表达也降低,提示Rb1干预抑制MCT致PAH大鼠Ca NBβ-NFAT表达上调;(3)Rb1抑制CPA诱导MCT致PAH大鼠PASMCs胞浆[Ca2+]i升高的作用,提示Rb1抑制PAH大鼠PASMCs的SOCE功能的增强;(4)Rb1抑制MCT致PAH大鼠PASMCs的增殖和迁移,并促进凋亡,提示Rb1干预抑制PAH PASMCs Ca2+-Ca N-NFAT介导的功能增强。结论:Cs A干预抑制MCT致PAH大鼠模型,并抑制大鼠PASMCs的增殖和迁移,促进凋亡,其机制可能与Cs A干预下调MCT致PAH大鼠NFATc3/4的表达有关。Rb1通过抑制MCT致PAH大鼠PASMCs SOCE功能的增强,抑制Ca2+-Ca NBβ-NFAT信号通路,发挥其抑制细胞增殖和迁移并促进凋亡的作用,可能作为治疗PAH的靶向药物。综上所述,Ca2+-Ca N-NFAT信号通路在MCT致PAH致病过程中起着关键作用。NFATc2/4是细胞生长增生所必需的,而NFATc2/3/4与PAH PASMCs的增殖密切相关。Rb1通过抑制MCT致PAH大鼠PASMCs SOCE的功能增强,下调Ca NBβ–NFAT信号通路信号分子的表达,减轻血管重塑,抑制PAH病程。以上结果提示Ca2+-Ca N-NFAT信号通路在PAH发病过程中起重要作用,为指导PAH治疗提供新依据和新靶点,Rb1并可能成为治疗PAH的新靶向药物。