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抗CD3×抗Pgp(anti-CD3/anti-Pgp)diabody治疗P-糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)高表达的多药耐药(Multidrug resistance,MDR)肿瘤具有良好应用前景,其杀伤肿瘤的作用主要由外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)中活化的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)来完成。因此,采用促进T细胞活化的方法可进一步增强PBL的抗肿瘤效果。本文从两方面进行了相关的研究。1.利用可溶型4-1BBL促进PBL活化4-1BB/4-1BBL作为一对重要的共刺激信号分子,通过促进活化的细胞毒淋巴细胞增殖、减少凋亡、延长存活时间、甚至增加细胞内颗粒酶、穿孔素的蓄积等机制调节T细胞活化,有助于机体达到最佳状态的抗肿瘤细胞免疫反应。本文第一部分用原核表达的可溶型人4-1BBL胞膜外区蛋白(extracellulardomain of human 4-1BBL,ex4-1BBL)来调节PBL的抗肿瘤反应。用免疫组化、PI染色和放射免疫法确认ex4-1BBL具有与4-1BB特异结合、减少Jurkat细胞凋亡和促进其释放IL-2活性后,进一步研究发现该蛋白能够促进PBL增殖(191.66%vs 146.67%,P＜0.05)和分泌Il-2(54.26±5.92 pg/ml vs 22.57±6.53pg/ml,P＜0.05),使PBL释放的乳酸脱氢酶(LDH)减少,改善其存活状态。在体外细胞毒杀伤实验中,ex4-1BBL联合anti-CD3/anti-CD20或anti-CD3/anti-Pgp微型双功能抗体,在不同的效靶比均能增强PBL对靶向细胞(Raji或K562/A02)的杀伤作用。在体内联合应用PBL、ex4-1BBL和anti-CD3/anti-Pgp diabody治疗裸鼠K562/A02移植瘤,能显著控制肿瘤生长并清除肿瘤,观察至100天未见肿瘤复发。因此,ex4-1BBL作为一种免疫调节蛋白,能够促进T细胞的活化,进而增强基于PBL的抗肿瘤生物治疗的效果。ex4-1BBL可能成为一种新型的、应用广泛的辅助抗肿瘤药物。2.构建四价形式的anti-CD3/anti-Pgp双功能抗体双功能抗体也称为双特异抗体(bispecific antibody,BsAb),其四价结构能够增加分子量和结合域,延长半衰期和增加结合力,间接延长抗体的作用时间。同时,增加对T细胞CD3分子的结合价能进一步促进其活化,也有利于PBL抗肿瘤作用。因此,为了发挥diabody的靶向优势并克服其不足,本文第二部分构建了四价形式的抗体并在原核系统进行表达。为了增加可溶型蛋白的表达量,先后采用优化表达温度和时间、改变培养基组成和更换载体等方法。优化表达条件后使产量得到提高,可供进一步研究蛋白功能。