论文部分内容阅读
以CD命名为主的人类白细胞分化抗原（human leukocyte differentiation antigen，HLDA）参与机体免疫活性细胞识别抗原，充当某些补体片段、IgFc段、细胞因子、病毒等的受体，介导细胞间、细胞与基质间的相互作用，参与细胞活化、信号转导、成熟分化以及免疫细胞效应功能的发挥，与机体免疫应答、炎症反应、造血调控、创伤愈合、凝血、肿瘤发生和转移等重要的生理和病理过程密切相关。 血小板/T细胞活化抗原1（platelet and T cell antigen 1，PTA1）是一种新的白细胞分化抗原，在2000年召开的第七届人类白细胞分化抗原国际协作组（HLDA7）会议上，被命名为CD226。PTA1最早通过单克隆抗体Leo A1所发现，表达于活化的T细胞表面，称为T细胞谱系特异的活化抗原1（T lineage-specific activation antigen1，TLiSA1）。随后发现也表达于血小板，随即命名为血小板T细胞活化抗原1。又名DNAM-1（DNAX accessory molecue-1）。PTA1也表达于NK细胞、活化内皮细胞以及前髓样细胞和巨核血小板谱系。该分子1996年基因克隆成功，含有7个外显子，cDNA全长2603bp，编码336氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，分子量为67kDa，含有8个N连接、3个O连接的糖基化位点。胞浆区近膜端前8个氨基酸中富含7个精氨酸，胞浆区还有7个苏氨酸、6个丝氨酸以及3个酪氨酸。属免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）成员，胞膜外区有2个V样结构域，是目前发现的IgSF中唯一仅含有2个V样结构域的分子。与表达于杀伤性T细胞（CTL）的Tactile（CD96）有22％的同源性，与BGP-1、CD36、PRR和果蝇神经胶质蛋白Neuroglian也有一定的同源性。主要参与NK细胞、CTL的杀伤功能，与血小板的凝集有关。 我们采用亲和层析法，从血小板表面纯化了天然CD226分子，纯化的蛋白分子保持了较好的免疫反应性，以此为免疫原制备的抗CD226分子的多克隆抗体效价达4×10-5经Western blot鉴定，多抗识别纯化分子的分子量为67kDa。以纯化的CD226分子为免疫原，免疫Balb/c小鼠，制备了7株分泌抗CD226分子的单克隆抗体杂交 第四军医大学博士学位论文 英文摘要 瘤 FMU．7，多次传代和长期培养可稳定分泌单克隆抗体，腹水效价一般在 10‘．10 一。在间接 ELISA实验中，与天然 CD226分子和 p“lflg均有良好的反应性，与 hlgG无交叉反应。所有抗体可结合 COS7细胞瞬时转染的 CD226分子。采用生物 传感器单抗配对方式表位分析（palnNise i of印itope mopping）的方法，发现 FMUI－7、Leo AI和 New EI可分别识别 CD226分子 7个不同的表位。其中，FMUI 和 FMUZ以及 FMU4和 FMUS识别相同的表位，其余均识别不同的表位。Le。AI 和New EI、FMU6和FMU7识别的表位较接近。分别以Leo AI、NewEI、FMUI 或FIAUZ为包被抗体，以FMU3作为酶标抗体，可建立双抗体夹心ELISA，用于检 测可溶性 CD226分子。除 Leo AI和 FMU3外，其余抗体可应用于 Western blot实 验。 建立了 Leo AI与抗 CD226 PoAb双抗体夹心 ELISA方法，首次发现人活化外 周血单个核细胞培养上清中和人血清中存在可溶性 CD226分子（sCD226），正常人 血清中 SCD226水平为 36．23士4．siP g／L，肿瘤和一些发生移植排斥反应等临床疾病 患者血清中SCD226水平升高，肺癌、贲门癌、脑膜瘤、肾肿瘤及睾丸肿瘤等患者 血清 SCD226为 57．26rt．00卜叭，从而表明血清中 SCD226水平的升高与一些临床 疾病有关。 通过构建 PTA分子胞膜外区不同结构域截断突变体真核表达载体，瞬时转染 COS7细胞，间接免疫荧光染色、流式细胞术分析结果表明，识别CD226分子胞膜 外区的 9株单抗中，Leo AI、New EI、FMU、FMUZ、FMU4和 FMUS识别的表 位位于DI结构域，FMU6和FMU7识别的表位位于DZ结构域，PMU3识别的表位 位于＊结构域，且紧邻DZ结构域。在混合淋巴细胞培养（MLC）培养的第0天， 分别加入CD226分子的单抗，仅Leo AI、New EI、FMUI、FMUZ和FMU3能够 明显抑制 MLC诱导的 NK和 CTL的杀伤活性，抑制率分别为刀．3％和 49二％。在 重导向杀伤试验（RCA）中，Leo AI、New EI、FMUI、FMUZ和 FMU3单抗可以 明显上调NK细胞的杀伤水平，在M：50／l时，将NK细胞的特异性杀伤率上调 至 70o（对照 20o），提示CD226分子胞膜外区 VI结构域参与NK和 CTL的功能。 所有识别 CD226分子胞膜外区的单克隆抗体中，仅 Leo AI、New EI、FMUI、 FMUZ和liU3可结合活化Jurkat细胞、MLC诱导的活化T细胞、Hutl02BZ细胞 以及血小板表面的CD226