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日本血吸虫病是一种人畜共患的寄生虫病,它严重威胁着疫区人的健康和生命安全,同时也给畜牧业带来巨大的经济损失,被世界卫生组织列为全球重点防治疾病之一。日本血吸虫病主要分布在中国、日本、菲律宾及印度尼西亚等西太平洋地区的一些国家。在我国日本血吸虫病流行于长江流域及其以南13个省、市、自治区。大量调查研究表明,家畜是血吸虫病流行最主要传染源和污染源。控制传染源是综合防治疫病、扑灭疫情的重要环节,而控制传染源的前提是确诊传染源。因此,应用灵敏、快速、经济的诊断方法确诊传染源,已成为日本血吸虫病流行病学调查、疫情监测以及控制其流行和扑灭疫情首需解决的问题。
本实验研究的重组蛋白中的Sj22.6和GST是被认作为日本血吸虫病诊断和疫苗研究具有极大优势的两种候选分子。有研究表明,这两种蛋白不但可以应用于血吸虫病的诊断,并且也是一种血吸虫疫苗的候选分子。本研究根据已知基因序列设计引物,以提取的日本血吸虫的总DNA为模板,通过PCR技术扩增了Sj22.6全长基因,构建原核表达质粒pGEX-KG-Sj22.6并进行了测序。在GenBank上Blast进行比较,发现它们与GenBank收录的相关基因的核苷酸序列同源性均达到99%以上;实验结果表明rSj22.6能在E.coli BL21-CodonPlus中实现了高效表达,表达产物经Western-blot检测分析表明具有较强的免疫反应原性。
利用重组融合蛋白rSj22.6作为诊断抗原建立了LAT诊断方法。特异性实验结果显示该方法具有很好的特异性,并不与常见的牛病原体血清发生反应。且与日本血吸虫阳性血清反应能检测到最高1:128稀释血清中的特异性抗体;诊断试剂的批内(间)重复试验结果显示LAT凝集效价不发生变化;诊断试剂在4℃贮存下的保质期均超过2个半月。以上结果表明,所建立的乳胶诊断方法均具有较高的特异性、较好的敏感性、稳定性及较长的保质期(4℃)。
用建立的rSi22.6-LAT方法与rsi22.6-ELISA同时检测249份牛场血清,结果显示总符合率为88.8%(221/249),rSi22.6-LAT检出率较rSj22.6-ELISA高4.0%。
利用日本血吸虫尾蚴感染5头实验牛,成功复制了日本血吸虫病。
利用建立的LAT诊断方法监测了牛体内日本血吸虫抗体水平的动态变化。结果表明:在首次感染血吸虫的第1~3周就能检测到特异性抗体,第6~10周抗体水平达到高峰,随后开始下降,在感染后18w逐渐转阴。
本研究中rSj22.6-LAT的诊断方法的建立,解决了目前日本血吸虫病不易快速准确简便诊断的难题,对弓形虫病的临床诊断、疾病控制、基层的广泛推广等均具有重要意义。