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目的：缺血性脑损伤是主要的致死、致残性疾病，为患者家庭和社会带来沉重的负担，但至今尚无有效的治疗策略来改善其预后。短暂的、亚致死性缺血预处理能使细胞和组织对随后发生的长时间的致死性脑缺血损伤起到保护作用，这一现象被称为缺血耐受。磷脂酰基醇3-激酶PI3K/Akt信号通路在缺血预处理过程中发挥神经保护作用。Cbl-b属于Cbl原癌基因家族成员之一。在T细胞中Cbl-b通过泛素化PI3K的P85亚基，负调控PI3K/Akt信号通路，抑制T细胞的活化。Cbl-b对PI3K/Akt通路的负调控作用在T细胞、骨瘤细胞、B细胞、肥大细胞等多种细胞中都有发现。我们研究组先前的研究表明，在大鼠局灶性脑缺血模型中缺血耐受通过抑制Cbl-b、增加磷酸化Akt的表达来抑制细胞凋亡，从而起到神经保护作用。在T细胞内钙水平升高并与钙调素结合，从而使钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN）活化，活化的CaN使转录因子NFAT脱磷酸化并转移至核内，NFAT作为一种转录因子调节Cbl-b基因的表达。本研究利用PC12细胞系建立氧糖剥夺缺血耐受模型，观察Ca2+/CaN/Cbl-b与PI3K/Akt在这一过程中的相互作用关系，研究氧糖剥夺预处理时它们在细胞凋亡中的作用和可能机制，并进一步探讨了尼莫地平、MK801等钙离子拮抗剂在药物预处理方面的作用。实验方法：1.采用氧糖剥夺方法建立细胞缺血及预处理模型。2.采用MTT方法测定细胞生存率。3.采用光学显微镜观察细胞形态变化，并采用Hoechst33258细胞核染色检测凋亡细胞。4.采用Real time PCR方法半定量检测泛素连接酶Cbl-b的mRNA的转录水平。5.采用Western blot方法检测CaN、Cbl-b、p-Akt、 p-GSK3β、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表达。6.统计学处理：所有数据均为6-8次独立实验结果，以均值±标准差表示。应用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析。实验结果：1. MTT方法检测细胞生存率结果表明预处理降低缺血对PC12细胞的损伤：与正常对照组相比，缺血组生存率显著降低（P<0.05）;与缺血组相比，预处理组细胞存活率升高（P<0.05）。2. Real time PCR方法检测Cbl-bmRNA结果表明预处理降低Cbl-b的转录：缺血组的Cbl-b转录水平高于对照组，两组之间的差异有统计学意义（P<0.05）。预处理组的Cbl-b转录水平低于缺血组，两组间的差异有统计学意义（P<0.05）。预处理前加入PI3K特异性抑制剂LY294002抑制Cbl-b转录的减低。3. Western blot方法检测不同蛋白表达水平结果表明预处理通过CaN和Cbl-b调控PI3K/Akt通路，发挥神经保护作用：缺血组CaN和Cbl-b表达增加，但p-Akt、p-GSK3β表达显著减低；预处理显著抑制CaN和Cbl-b的表达，激活Akt和GSK3β；PI3K通路特异性抑制剂LY294002部分的抑制预处理后CaN和Cbl-b的减低，但显著抑制Akt和GSK3β的激活。4. Western blot方法检测不同蛋白表达水平结果表明预处理对CaN、Cbl-b和Akt激活时间不同：预处理早期（0-6h）Cbl-b的表达逐渐增加，6h至峰值。之后随着时间延长Cbl-b的表达逐渐减少，而p-Akt的表达持续增多。6h后Cbl-b呈明显下降趋势，而p-Akt活性逐渐增强，两者呈反向变化。CaN直接达峰，基本与Cbl-b伴行，呈同向变化。5. Western blot方法检测不同蛋白表达水平结果表明预处理通过抑制凋亡发挥神经保护作用：预处理后细胞中Bcl-2的表达显著升高，而Caspase-3的表达显著降低，抑制细胞凋亡，提高细胞存活率；PI3K通路特异性抑制剂LY294002显著抑制Bcl-2的升高和Caspase-3表达的降低，抑制了预处理的保护作用。6. Western blot方法检测不同蛋白表达水平结果表明Ca2+参与缺血预处理的调控：缺血预处理显著降低CaN和Cbl-b的表达；而缺血预处理前加入钙离子载体A23187抑制预处理引起的CaN和Cbl-b表达的降低，显著减弱缺血预处理的保护作用。7. MTT方法检测细胞生存率结果表明尼莫地平和MK801降低缺血对PC12细胞的损伤：尼莫地平或MK801药物预处理的细胞生存率升高（与缺血组比较p<0.05），显著降低缺血对细胞的损伤，LY294002显著降低尼莫地平和MK801的保护作用。8. Western blot方法检测不同蛋白表达水平结果表明尼莫地平或MK801通过CaN和Cbl-b调控PI3K/Akt通路发挥神经保护作用：缺血组CaN和Cbl-b表达增加，但p-Akt、p-GSK3β表达显著减低；尼莫地平或MK801显著抑制CaN和Cbl-b的表达，激活Akt和GSK3β；PI3K通路特异性抑制剂LY294002不影响尼莫地平或MK801处理后CaN和Cbl-b的表达，但显著抑制Akt和GSK3β的激活。9. Western blot方法检测不同蛋白表达水平结果表明尼莫地平或MK801通过抑制凋亡发挥神经保护作用：尼莫地平或MK801处理后细胞中Bcl-2的表达显著升高，而Caspase-3的表达显著降低，抑制细胞凋亡，提高细胞存活率；PI3K通路特异性抑制剂LY294002显著抑制Bcl-2的升高，抑制了尼莫地平和MK801的保护作用。结论：1.缺血组CaN、Cbl-b的表达增加，p-Akt/p-GSK的表达减少，减少抗凋亡蛋白Bcl-2、增加Caspase-3的表达而导致细胞损伤，缺血预处理逆转了这一过程而起到神经保护作用。CaN可能是通过使转录因子NFAT脱磷酸化并转移至核内，NFAT作为一种转录因子调节Cbl-b基因的表达，Cbl-b可能通过泛素化PI3K/Akt通路的p85调节亚基而起作用。2.钙离子载体A23187和环孢素A在缺血及预处理的过程中起到重要的调控作用，说明Ca2+浓度变化可能是预处理保护作用的启动因素，同时也为Ca2+拮抗剂起到药物预处理的保护作用提供了一定的依据。3.尼莫地平、MK801两种不同类型的钙离子拮抗剂均可减少CaN和Cbl-b的表达，进而作用于生存通路PI3K/Akt/GSK信号通路调控促凋亡及抗凋亡蛋白之间的平衡，它们可能通过与缺血预处理相同或相似的一条或多条途径发挥保护作用。相比于缺血预处理，药物预处理临床使用风险小，更易实现。