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猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是一种急性接触性肠道传染病,以引起哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水为主要特征,一周龄内哺乳仔猪感染该病后死亡率可达100%,给世界养猪业带来巨大的经济损失。目前尚未有有效的疫苗和药物。PED病原为猪流行性腹泻病毒(Porcie Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)。PEDV的N基因编码的N蛋白是一种多功能的病毒蛋白,但缺乏与其相互作用蛋白的研究报道。为进一步了解N蛋白的生物学功能,探究N蛋白在PEDV复制过程中发挥的作用,本研究对N蛋白的相互作用蛋白质组学进行研究,获得与N蛋白相互作用的细胞蛋白,为下一步筛选抑制PEDV感染的药物靶标提供理论依据。为获得N蛋白相互作用的细胞蛋白,首先以PEDV PEDV LJX01/2014毒株的cDNA为模板,扩增PEDV N目的片段,将目的片段与pEGFP-C1真核表达载体进行连接,成功构建pEGFP-N重组质粒。将重组质粒转染293T细胞后,利用Pull-down实验特异性沉淀pEGFP-N蛋白及其相互作用的细胞蛋白并进行质谱分析,质谱结果表明,125种细胞蛋白可能与N蛋白相互作用。为了对质谱分析结果进行验证,根据不同的与对照相比获得的不同的变化比值筛选4种细胞蛋白DHX9、NCL、KAP1和TCEA1,用Western blot、免疫共沉淀和共定位研究进行鉴定。Western blot结果表明在293T和Vero E6细胞中,用N蛋白作为诱饵进行pull-down实验,结果表明N蛋白与细胞蛋白DHX9、NCL、KAP1和TCEA1均有相互作用;同时在293T和Vero E6细胞中分别用抗DHX9、NCL、KAP1和TCEA1抗体进行免疫共沉淀,结果表明4种细胞蛋白均能与N相互作用。用共聚焦显微镜观察这4种细胞蛋白与N蛋白的共定位现象,结果表明在感染PEDV的Vero E6和pEGFP-N转染的293T细胞种,均发现NCL与pEGFP-N存在共定位,而与其他3各蛋白没有共定位。本研究成功获得PEDV N蛋白的相互作用蛋白质组学,为进一步研究PEDV的致病机制奠定基础。