微生物脂肪酶(E.C.3.1.1.3)以独特的底物特异性、温度稳定性、碱性稳定性、抗蛋白酶解、有机溶剂稳定性与对映异构选择性等特性，被广泛应用于洗涤剂、食品、油脂加工、药物合成、化妆品和造纸等工业中。微生物脂肪酶已成为工业用脂肪酶的重要来源，但由于脂肪酶基因受到较为严谨的调控，限制了脂肪酶产生菌的发酵水平的提升。脂肪酶的高效重组表达也面临一些问题，如重组脂肪酶可能对宿主产生毒性；过量表达会产生包涵体；高效表达会对宿主细胞代谢产生不利影响而限制了表达量的积累等。细菌脂肪酶折叠机理的探究，在脂肪酶异源表达效率的提高与生产菌株的改造等实际应用中发挥着重要的作用。本论文中我们着重研究了来源于不动杆菌的脂肪酶及其特异折叠酶的功能以及两者之间的蛋白互作，以揭示依赖于脂肪酶特异折叠酶的脂肪酶的蛋白折叠机制。不动杆菌Acinetobacter sp. XMZ-26（菌种保藏号为ACCC05422）为本实验室从冰川土样中分离获得的。利用基因组文库与TAIL-PCR的相结合的方法从其基因组中克隆到含有脂肪酶与脂肪酶特异折叠酶编码基因的新操纵子(lif26/lip26)，脂肪酶基因(lip26)位于折叠酶基因(lif26)的上游（GenBank数据库登录号分别为GQ227699与GQ227701）。脂肪酶Lip26属于脂肪酶亚家族I.1，折叠酶Lif26属于脂肪酶特异折叠酶的第三家族，与已知脂肪酶和折叠酶的最高一致性是来源于Acinetobacter sp. SY-01的LipA与LipB (Lif)，其一致性分别为46.4与37.3%，这表明它们均是新的脂肪酶与特异折叠酶，且操纵子lif26/lip26具有新颖性。无信号肽的脂肪酶Lip26与无N-末端疏水跨膜螺旋的Lif26在大肠杆菌E. coli中进行了异源表达。重组Lip26表达为无脂肪酶活性的包涵体，但用尿素变性后可在纯化的重组Lif26的辅助下经体外稀释复性获得有活性的构象。复性Lip26的酶学性质检测表明Lip26在55°C与pH9.0的条件下作用于对硝基酚豆蔻酸酯表现出最高活性；具有较宽的底物谱，可水解具有不同碳链长度的对硝基酚酯类底物；Ca2+、Mn2+与Ba2+等离子均可明显促进Lip26的活性；在许多水溶性的有机溶剂与一些去污剂存在下，Lip26仍可保持较好的活性。脂肪酶特异折叠酶Lif26不仅可体外辅助Lip26的复性，在体内通过与Lip26的共表达使其表达为有活性的可溶性蛋白。Lif26是以立体分子伴侣的方式为Lip26提供折叠所必须的信息，使其可跨越能障在较短的时间内完成折叠。利用GST pull-down实验与酵母双杂交的方法从体外与体内共同验证了Lif26与Lip26之间存在直接的相互作用。同时，采用酵母双杂交的方法鉴定了不同来源的脂肪酶与折叠酶的互作，结果表明Lif26与假单胞杆菌的Lip4没有蛋白相互作用，同时假单胞杆菌的Lif4与Lip26也没有蛋白相互作用，也无法辅助Lip26的折叠，这说明折叠酶对脂肪酶的作用是具有种属特异性。为了进一步揭示Lip26与Lif26的互作机制，以来源于Burkholderia glumae的Lif-LipA复合体的结构(PDB ID：2ES4)为模板，对Lif26-Lip26复合体进行同源模建与优化。结果显示，Lif26由11个α-螺旋组成以夹钳的形式环绕在脂肪酶Lip26周围，在N-末端与C-末端存在N-末端结构域(α1-α3)与C-末端结构域(α9-α11)，两末端结构域之间有延伸的水平臂(α4-α8)连接。通过将Lif4与Lif26的不同模块进行模块替换实验发现中间模块（水平臂）与C-末端结构域(α9-α11)可能参与决定种属特异性，而N-末端结构域(α1-α3)对种属特异性影响不大。Lif26的缺失实验也表明C-末端结构域尤其是最后一个α-螺旋α11是Lif26与Lip26发生蛋白互作所必须的。通过计算机辅助设计建立了一个鉴定蛋白互作关键氨基酸的系统方法，即首先同源模拟目标蛋白的三维结构，利用分子动力学模拟与互作能量计算相结合的方法筛选互作可能的关键氨基酸，再对选定的位点进行定点突变与定点饱和突变，鉴定出起重要作用的关键氨基酸及其所发挥的功能。利用这个方法我们鉴定出参与和Lip26互作的Lif26关键氨基酸为位于C-末端α11的Arg332。定点饱和突变表明，Arg332是不能被替换的非常保守氨基酸，它可与Lip26的Glu112形成较强的离子键，决定Lif26与Lip26互作的特异性。并且在Lif26的空间结构中，位于Arg332周围的氨基酸如位于C-末端α9的Trp288也必须为芳香族的氨基酸，可与Arg332形成阳离子-π键以稳定Arg332的构象，而有利于与Lip26的互作。